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本研究分别采用RNA干扰技术和合成吲哚类小分子抑制剂的方法,研究大肠杆菌主动外排泵AcrAB-TolC对大肠杆菌耐药性的影响。
通过对临床分离480株猪源大肠杆菌进行药敏实验初步筛选耐药菌株,使用氯霉素、四环素和氨基糖苷类3类抗生素耐药基因PCR试剂盒进行联合检测,筛选出耐药菌株Fj307。使用氯霉素对ATCC25922进行人工诱导耐药性,获得耐药菌株YD02。实验通过MIC检测和耐药基因PCR检测,确认该2株菌存在外排泵AcrAB-TolC引起的耐药性。
以大肠杆菌AcrAB-TolC外排系统中膜融合蛋白AcrA蛋白为干扰目标,针对其编码基因序列设计合成了4对siRNA干扰分子:siRNA35、siRNA164、siRNA929,siRNAcontrol通过生长抑制实验从表观水平检测该4对siRNA抑制外排泵活性的能力,干扰结果显示:在干扰实验进行中7h~10h间时,在3种氯霉素浓度梯度下128、64、32(ug/mL)均能检测出各siRNA实验组和对照组间的吸光度数据存在差异(P<0.01),实验对氯霉素浓度32ug/mL实验组进行统计分析,5个不同实验处理的吸光度在总体程度上差异极其显著(P<0.01),其中siRNA164使耐药菌吸光度降低到对照的1/4,和其他组的siRNA差异极显著,说明siRNA164能够通过干扰外排泵关键蛋白AcrA造成大肠杆菌耐药性的逆转。
针对大肠杆菌AcrAB-TolC外排系统中外膜通道蛋白TolC的空间结构,以TolC蛋白外膜出口处Asp153与Tyr362两个关键氨基酸设计小分子化合物作为外排泵抑制剂,实验使用6-氨基吲哚和6-甲酸甲酯吲哚为原料,通过化学方法合成了4个吲哚类衍生物作为外排泵抑制剂。实验以Fj307、YD02为阳性菌株,ATCC25922、Twlb为阴性对照,检测小分子抑制剂加入后实验菌株在几种抗生素条件下MIC的变化,结果显示,合成的小分子使大肠杆菌对氯霉素、四环素、红霉素类和环丙沙星的MIC值下降最多达32倍,说明有抑制活性。
对外排泵的研究不仅有助于阐明细菌耐药本质,同时研制新型抗菌药物也具有重要应用价值,这两方面的研究工作为进一步改造对防治大肠杆菌疾病,减少抗生素使用和食品中药物残留,提高食品安全具有良好的应用前景。