猪链球菌猪溶血素诱导血小板聚集和血小板/中性粒细胞聚集体形成机制的研究

来源 :中国人民解放军军事医学科学院 | 被引量 : 1次 | 上传用户:xiaogege0451
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猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,S.suis 2)作为新发的重要人兽共患病病原体,在我国江苏和四川引起暴发流行,主要引起中毒性休克综合征(streptococcal toxic shock syndrome,STSS)、脑膜炎、菌血症等临床表征,严重威胁着人们的身体健康。中毒性休克综合征患者临床症状主要为高热、休克、皮肤黏膜出血、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)等,最终引起患者多器官微循环障碍、功能衰竭,是导致患者死亡的重要原因。中毒性休克综合征死亡患者解剖发现,多脏器出现微血栓,血液凝固性降低,说明患者凝血系统出现了紊乱,提示猪链球菌与宿主血液系统的相应成分发生相互作用,引起了患者凝血功能障碍,但是具体的毒力因子与作用机制仍未阐明。筛选出相应的毒力因子,并且阐明相应的作用机制,对于猪链球菌中毒性休克综合征患者的临床治疗具有一定的指导意义。血小板作为人体血液中的主要成分,在生理性止血、凝血过程中发挥着核心作用,血小板的激活是血栓形成的启动因素同时血小板也是构成微血栓的主要成分。通过病人出血的临床表现和微血栓的解剖学特征,我们猜想可能是猪链球菌的某种毒力因子与血小板相互作用,激活了血小板,活化后的血小板粘附在血管内皮细胞表面、相互聚集,形成了微血栓。由于血栓的形成,消耗掉了血液循环中大量的血小板,导致了凝血功能降低,所以病人会出血、休克。为了验证我们的猜想,我们以2005年的高致病标准测序株05ZYH33为主要研究对象,寻找与血小板相互作用的毒力因子并探讨相关的作用机制,我们设计并且进行了相应的实验。本实验室保存了05ZYH33菌株,同时构建了猪溶血素(Suilysin,SLY)基因缺失株ΔSLY、溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)基因缺失株ΔMRP、腺苷合成酶(Ssads)基因缺失株ΔSsads、H因子结合蛋白(factor H binding protein)基因缺失株ΔFHb等突变株,为我后续的实验提供了菌株材料。本实验首先使用分离到的高致病性猪链球菌野生株05ZYH33细菌菌体与健康人全血中分离到的血小板相互作用,通过检测血小板活化标志物ATP、CD41a、CD62P等指标,发现猪链球菌菌体并没有引起血小板的激活,与阴性对照没有统计学差异。之后我们又使用05ZYH33对数中期和稳定期的培养上清与血小板相互作用,发现ATP、CD41a和CD62P等血小板活化指标只有在稳定期上清与血小板相互作用时才会出现不同程度的增加,与阴性对照THB培养基组相比较具有统计学差异,而对数中期培养上清不能激活血小板。说明了猪链球菌上清中存在着某种成分可以激活血小板,并且该物质是在细菌稳定期才会分泌到菌外,而猪链球菌菌体自身成分并不能直接激活血小板。同时,我们使用血小板聚集仪发现,只有猪链球菌稳定期分泌的这种物质可以诱导血小板聚集,菌体本身也不能够诱导血小板聚集,血小板聚集结果与血小板激活结果相一致,进一步说明了猪链球菌在稳定期分泌的某种毒素可以激活血小板,并且进一步诱导活化的血小板聚集。为了进一步探究猪链球菌激活血小板的毒力因子,我们使用本实验室前期构建的多种基因缺失株稳定期培养上清与血小板相互作用,来检测血小板ATP、CD41a和CD62P表达情况和血小板聚集程度,发现只有突变株ΔSLY不能激活血小板和诱导血小板聚集。由于SLY作为一种外分泌的毒素,不存在与猪链球菌表面,并且只有在稳定期才会分泌,突变株ΔSLY由于SLY基因缺失,上清中不能表达SLY,这些结果初步证实了猪链球菌分泌的猪溶血素SLY是激活并引起血小板聚集的毒力因子。我们通过基因工程方法构建了重组猪溶血素(r SLY)工程菌,体外表达纯化了SLY,使用SLY与血小板相互作用,可以激活血小板,并且通过血小板聚集仪和电子显微镜我们从宏观和微观上证实了SLY诱导血小板聚集,而Fhb、MRP、Ssads等已知的猪链球菌毒力因子都不能够引起血小板聚集,结合猪链球菌菌体、对数期上清、稳定期上清引起血小板聚集结果,进一步证实了SLY是猪链球菌唯一的可以诱导血小板聚集的毒力因子。筛选到毒力因子之后我们进一步探究了SLY激活血小板的具体的机制。因为SLY可以在细胞膜上成孔,我们猜想SLY是否是通过在血小板表面成孔的方式激活了血小板,首先我们通过向05ZYH33稳定期上清和SLY中加入一定浓度胆固醇,与SLY结合,封闭其成孔能力,发现不能激活血小板,同时我们用第353位氨基酸突变的丧失打孔能力的SLY(SLY(P353V))来刺激血小板,也不能够激活血小板,另外,我们使用磷脂酶C(PLC)抑制剂U73122并不能抑制SLY诱导的血小板活化,说明了SLY不是通过血小板表面的G蛋白偶联受体而是通过在血小板表面成孔而激活了血小板。然后我们向富血小板血浆(PRP)中加入常规的钙离子螯和剂EGTA,发现可以明显的抑制05ZYH33稳定期上清和SLY诱导的血小板活化和聚集,说明SLY诱导的血小板聚集需要血浆中的钙离子参与。我们又通过钙离子内流实验,发现SLY作用于血小板会引起血小板钙离子内流,胆固醇封闭SLY成孔之后,再与血小板相互作用不会引起钙离子内流,同时血小板也不会激活,这些结果综合起来说明了SLY通过在血小板表面打孔,导致了钙离子内流,激活了血小板。血小板活化后表面分子GPⅡb/Ⅲa亚基CD41a含量仅仅增加了约30%,而GPⅡb/Ⅲa与纤维蛋白原(Fg)结合能力大大增加,使用Eptifibatide封闭掉GPⅡb/Ⅲa与Fg结合位点之后,明显的降低了SLY引起的血小板聚集,说明了SLY激活血小板后导致了GPⅡb/Ⅲa构想变化,与Fg亲和力增强,从而引起了血小板聚集。阿司匹林作为环加氧酶(COX)的抑制剂,同样可以降低SLY诱导的血小板聚集率,通过Eptifibatide和阿司匹林两种抑制剂对血小板聚集效果的评价,我们发现GPⅡb/Ⅲa在血小板聚集中起着主要作用。Eptifibatide同时可以略微降低一点CD62P的表达量,说明了GPⅡb/Ⅲa与Fg结合能够把胞外信号,传递到胞内,一定程度上降低了血小板脱颗粒程度。SLY引起血小板钙离子内流之后,激活血小板内相应的钙调蛋白,引起血小板活化。我们使用肌球蛋白轻链激酶(MLCK)抑制剂ML-7和Rho蛋白抑制剂Y27632与血小板相互作用,来封闭相应的钙调蛋白的活性,结果显示ML-7抑制了血小板的激活,而Y27632对血小板活化没有影响,同时用流式细胞仪检测发现只有ML-7抑制了血小板CD62P高表达,说明了钙离子进入血小板内激活了肌球蛋白轻链激酶(MLCK),MLCK活化肌球蛋白轻链(MLC),导致血小板脱颗粒,释放CD62P到血小板表面,而不是通过PLC-IP3/DAG-MLCK和Rho-ROCK-MLCK途径激活了血小板。CD62P作为一种整合素蛋白,可以与中性粒细胞(PMNs)表面的受体PSGL-1结合,形成血小板/中性粒细胞聚集体(platelets/neutrophils aggregation,PNA),使用anti-CD62P单克隆抗体可以明显降低PNA形成率,证实了血小板通过其表面P-选择素与PMNs形成PNA。PNA在中性粒细胞渗出内皮细胞到达炎症部位起着关键作用。我们使用05ZYH33野生株和ΔSLY基因突变株分别感染BALB/c小鼠,36h后05ZYH33野生株感染的小鼠与ΔSLY基因突变株感染的小鼠相比,全血中血小板体积增大和数量降低,在05ZYH33野生株感染的小鼠肝脏组织病理切片中发现了微血栓和凝固性坏死,ΔSLY基因突变株感染的小鼠中未见明显异常,说明了SLY体内诱导了血小板活化,并且形成了微血栓。总结来讲,本实验发现猪链球菌分泌的SLY,通过在血小板膜上成孔的方式引起钙离子内流,激活血小板内的MLCK与膜表面GPⅡb/Ⅲa,依靠GPⅡb/Ⅲa的活化和CD62P的高表达介导了血小板的聚集和血小板/中性粒细胞聚集体(PNA)的形成,血小板的聚集会导致微血栓的形成,对多组织器官造成损伤,同时由于血小板消耗,会导致病人出血严重,另外血小板/中性粒聚集体的形成会触发炎症反应和促进中性粒迁移,聚集体也会参与血栓的形成,多种机制的共同作用导致病人出现死亡。希望我们的研究可以为猪链球菌病人的STSS治疗提供一定的理论依据。
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