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神经干细胞的发现,更新了以往认为神经元不能再生的传统观点,使人们对神经系统的结构和功能有了一个全新的认识。神经干细胞不仅可以作为研究神经发育的模型,并且,作为潜在的移植细胞的来源,为临床治疗神经系统疾患提供了一个新的有效治疗途径。如果神经干细胞能像造血干细胞那样得到深入研究,并且能够大量获得,进而异体移植成功,必然会对医学进步起重大的推动作用。目前,关于神经干细胞的研究虽然很多,但距离实际应用还有很大的差距。因此,选择神经干细胞作为研究对象,对体外培养的神经干细胞的生长特性,形态结构进行较深入的研究;并探讨诱导神经干细胞向神经元定向分化的有效方法;同时检测神经干细胞中DNA 拓扑异构酶II 的表达情况,期望能够找到调控神经干细胞增殖和定向分化的新切入点。本研究分四部分。 第一部分:大鼠神经干细胞体外生长特性 目的:介绍一种较成熟的大鼠神经干细胞体外培养方法,并观察其体外生长特性。方法: 1 神经干细胞的分离培养取新生大鼠(1d 之内)侧脑室前角周围的脑组织,用EDTA﹕胰蛋白酶(1﹕1)消化, 制成单细胞悬液,接种于无血清培养基(含B27 和20ng/ml bFGF,20ng/ml EGF 的DMEM/F12 培养基)中,观察神经干细胞的体外生长过程,并比较不同接种密度,不同传代时间对神经干细胞生长的影响。2 大鼠神经干细胞的鉴定2.1 nestin 免疫细胞化学:取传至第3 代细胞,传代后3d,做nestin 免疫细胞化学,一抗为兔抗鼠nestin 多克隆抗体(1:50),4℃,24h;FITC标记的二抗(1:30),37℃,2h。2.2 生长曲线绘制:取传至第3 代的神经干细胞,以5×10~5个细胞/ml 密