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目的:1.通过转染SiRNA干扰人YB-1基因的质粒(SiYB-1)和携带人YB-1基因的腺病毒表达载体pAdlEasy/YB-1(AdYB-1),探讨YB-1与小剂量三氧化二砷(As2O3)诱导的乳腺癌MCF-7细胞及胃癌BGC-823细胞自噬的关系。2.从自噬相关基因Beclin1和Bcl-2调控细胞自噬的机制着手在基因和蛋白水平初步探讨YB-1调控自噬的机制。
方法:1.Western-blot方法检测脂质体转染SiRNA干扰YB-1和腺病毒转染pAdlEasy/YB-1过表达YB-1的MCF-7细胞和BGC-823细胞中YB-1蛋白表达的变化。2.4μM/LAs2O3作用于转染SiYB-1和AdYB-1的MCF-7细胞及BGC-823细胞,运用Western-blot的方法检测各转染组细胞中自噬标记蛋白LC3-Ⅱ和p62的表达,MDC自噬特异性染料荧光染色观察自噬泡的聚集综合评价YB-1对As2O3诱导的肿瘤细胞自噬的影响。3.实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western-blot的方法检测自噬相关基因Beclin1和Bcl-2在MCF-7细胞及BGC-823细胞各转染组中的mRNA水平和蛋白水平表达情况。4.转染AdYB-1的MCF-7细胞及BGC-823细胞,用Bcl-2的抑制剂HAl4-1预处理后再用As2O3诱导,Western-blot方法检测各组中蛋白LC3-Ⅱ、p62和Beclin1的表达,MDC染色观察自噬泡的聚集。
结果:1.转染SiYB-1和AdYB-1的MCF-7细胞及BGC-823细胞,经Western-blot方法检测,与无意干扰组(HK)和空病毒组(AdGFP)相比,两细胞的SiYB-1组YB-1蛋白表达均明显降低(P＜0.05),AdYB-1组YB-1蛋白表达均明显升高(P＜0.05),显示转染有效。2.BGC-823细胞和MCF-7细胞各转染组经4μM/L的As2O3诱导后,Western-blot检测示AdYB-1能够抑制低剂量的As2O3诱导的肿瘤细胞内蛋白LC3-Ⅱ的转化和p62蛋白的降解,MDC染色后显微镜观察,与对照组相比蓝色荧光的强度明显减弱。相反,转染了SiYB-1的肿瘤细胞与对照组细胞相比,由As2O3诱导的细胞自噬水平进一步增强,自噬标记蛋白检测示SiYB-1组促进了As2O3诱导的细胞内LC3-Ⅱ蛋白的转化,p62蛋白的降解也明显增加,MDC染色可见自噬泡荧光强度增强,荧光颗粒明显增多。3.BGC-823细胞和MCF-7细胞各转染组经4μM/L的As2O3诱导后,qRT-PCR检测显示,与转染对照(AdGFP)组相比,AdYB-1组Bcl-2基因相对表达水平增高(P＜0.05);而干扰YB-1表达后,SiYB-1组Bcl-2基因相对表达水平较其转染对照(HK)组明显降低(P＜0.05),Beclin1基因表达在各组无统计学差异。Western-blot的方法检测各转染组Bcl-2蛋白和Beclin1蛋白,结果显示与转染对照组HK和AdGFP组相比,SiYB-1组Bcl-2蛋白表达降低(P＜0.05),而Beclin1蛋白表达增高(P＜0.05);AdYB-1组Bcl-2蛋白表达增高(P＜0.05),Beclin1蛋白表达降低(P＜0.05)。4.转染了AdYB-1的BGC-823细胞和MCF-7细胞,加入Bcl-2的抑制剂HA14-1预处理4h后再用As2O3诱导,Western-blot检测显示,AdYB-1组Beclin1蛋白表达降低,P62蛋白降解减少,LC3-Ⅱ蛋白减少,在加入HA14-1组Beclin1蛋白恢复表达,P62降解增加,LC3-Ⅱ升高。提示在Bcl-2的抑制剂HA14-1预处理后,As2O3诱导的自噬不能因转染AdYB-1而被抑制。
结论:1.在BGC-823细胞和MCF-7细胞中成功转染SiYB-1和AdYB-1改变YB-1的表达。2.YB-1能够抑制As2O3诱导的BGC-823细胞和MCF-7细胞的自噬水平。3.YB-1可能通过上调Bcl-2、抑制Beclin1,实现对As2O3诱导的肿瘤细胞自噬的抑制作用,为YB-1参与调控肿瘤细胞的自噬提出了新的机制。