【摘 要】
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牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体和牛呼吸道合胞体病毒作为牛呼吸道疾病的常见病原,可统称为牛呼吸道疾病综合征,严重威胁养牛业的健康。临床样品检测常用PCR法、q PCR、病原的分离鉴定等方法结果可靠,特异性强,但是由于养殖场等基层单位不具有相应的仪器设备,上述方法应用到基层养殖场有一定难度。为了解决这一难题,本研究利用环介导等温扩增方法,在反应液中预加入酸碱性染料中性红或甲酚红,建立了一种可以用肉眼直
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牛传染性鼻气管炎病毒、牛支原体和牛呼吸道合胞体病毒作为牛呼吸道疾病的常见病原,可统称为牛呼吸道疾病综合征,严重威胁养牛业的健康。临床样品检测常用PCR法、q PCR、病原的分离鉴定等方法结果可靠,特异性强,但是由于养殖场等基层单位不具有相应的仪器设备,上述方法应用到基层养殖场有一定难度。为了解决这一难题,本研究利用环介导等温扩增方法,在反应液中预加入酸碱性染料中性红或甲酚红,建立了一种可以用肉眼直接观察并判定结果的新型肉眼可视化(RT)LAMP检测方法,利用上述方法分别建立了牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)、牛支原体(M.bovis)的可视化(RT)LAMP检测方法,为牛呼吸道疫病的现场检测提供了便利。鉴于IBRV和M.bovis基因组为DNA,BRSV为RNA病毒,分别以相应的DNA序列和c DNA序列为模板。根据IBRV的g B基因、BRSV的N基因、M.bovis的opp D/F基因的保守区序列分别设计若干对特异性引物,通过对多对引物组、反应时间、反应温度以及各种显色剂的优化筛选。成功建立了IBRV、BRSV、M.bovis的可视化(RT)LAMP检测方法。可视化(RT)LAMP方法具有高度特异性,且与其他牛、羊呼吸道病原均无交叉反应。IBRV、M.bovis和BRSV靶基因的最小检出量分别为2.74×10~1copies/μL、2.54×10~1copies/μL、2.17×10~1copies/μL,与WOAH等推荐的(RT)q PCR检测方法进行比较,(RT)q PCR检出限分别为10~2copies/μL(IBRV)、1.91×10~1copies/μL(M.bovis)和10~3copies/μL(BRSV)。应用本方法检测采自河北省内养牛场的39份临床样品,结果显示三种病原均有检出且存在混合感染。其可视化(RT)LAMP阳性率分别为12.8%(IBRV)、15.4%(BRSV)、12.8%(M.bovis),与对比方法检测结果基本一致。本研究成功建立了关于牛呼吸道疾病三个病原的现场检测方法,可应用于大量临床样品的快速检测,为养牛业防控牛呼吸道疾病提供了便捷的检测方法。
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