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羊传染性脓疱病(Contagious Ecthyma),又被称作羊口疮,是羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV)引起导致的绵羊、山羊以及野生小型反刍兽的一种急性、高度接触性传染病。被该病感染的动物的口唇部,乳房部,生殖器官部位等最易受到侵害,在患处出现皮肤破溃,水疱,结痂等。羊传染性脓疱病还是一种人兽共患病,不仅给羊养殖产业造成巨大的经济损失,还同时威胁着相关人员的生命健康。羊传染性脓疱病目前尚无特效治疗药物,接种疫苗是最有效的防控手段。但是由于羊传染性脓疱病毒特有的免疫逃避机制,现在市售的灭活疫苗和弱毒疫苗在免疫保护效果等方面还有许多不足。而基因缺失疫苗作为一种新型疫苗,在羊传染性脓疱病的疫苗开发上拥有非常广阔的前景。同源重组基因敲除技术是常用的构建基因缺失株的方法,但传统的同源重组方法成功率低下,耗费时间极长。在本研究中,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术事先在基因缺失的目标区域引起DNA的双链断裂(DSBs),使得目标区域发生同源重组的概率大大提高。我们通过PCR扩增,寡核苷酸序列合成,载体连接等方法构建了同源重组穿梭质粒pUC57-vv7.5-EGFP-ORFV009;sgRNA表达载体质粒gRNA1、gRNA2、gRNA3、gRNA4;Cas9表达载体质粒这三种载体。通过共转染实验将sgRNA表达载体质粒和Cas9表达载体质粒共转染进OFTu细胞中,再对细胞接种Orf virus strain SY17株病毒,使得ORFV 009基因区域发生双链断裂(DSBs)。接下来再进行同源重组穿梭质粒的转染,通过同源重组修复(HDR)的方式增加同源重组发生概率,在荧光显微镜下观察绿色荧光获得ORFV 009基因缺失株。后续使用有限稀释法,对基因缺失病毒进行纯化和筛选,并对筛选后的基因缺失病毒进行PCR鉴定和基因测序鉴定。成功获得了一株ORFV 009基因缺失株。而且结果证明基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建ORFV 009基因缺失株的成功率高达91.6%,相较传统同源重组方法将效率提升了20倍以上。本研究还以ORFV 009基因缺失株作为疫苗备选株,对基因缺失病毒的致细胞病变(CPE)能力,一步生长曲线等生物学特性进行测定。结果显示ORFV 009基因缺失株的病毒可以正常感染细胞并在复制能力上与原始病毒无显著差异。之后将ORFV 009基因缺失株与原始病毒及PBS对照接种3月龄羔羊,证明ORFV009基因缺失株的致病能力相比原始病毒有明显下降。使用ORFV 009基因缺失株和PBS对照对3月龄羔羊进行免疫接种,并在接种3周后进行加强免疫。每周采集羔羊血清利用间接ELISA和细胞因子检测试剂盒检测其特异性抗体和细胞因子水平。结果显示ORFV 009基因缺失株可以诱导机体产生细胞免疫和体液免疫,但体液免疫水平不高,以细胞免疫尤其是Th1型免疫应答为主。在免疫接种6周后,使用Orf virus strain SY17株病毒对实验组和PBS对照组随机羔羊进行攻毒保护性实验,PBS对照组全部发病而实验组无发病病例。实验免疫保护率为100%上述研究结果对羊传染性脓疱病的基因缺失疫苗的开发提供了重要的方法依据和物质基础,对羊传染性脓疱病的防控有重要意义。