牡丹根际促生菌筛选、培养基优化及基因组测序

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牡丹是我国的国花,既是重要的观赏植物,也是重要的经济植物,主要分布在山东菏泽、河南洛阳等地。近几年来,由于长期种植、重茬栽培,牡丹受土传病害的影响日益加重,根腐病的蔓延严重影响了牡丹的产量与质量。从山东菏泽牡丹种植区采集根际土样,采用系列梯度稀释法对牡丹根际土进行微生物分离,共获得分离物1304个。采用平板对峙法筛选到牡丹根腐病拮抗菌26株,其中效果较好的有5株(菌株编号为MDJK10、MDJK30、MDYZ、MDJK11和MDJK44)。依据形态学观察、生理生化测定和16S rRNA基因序列分析结果,MDJK10、MDJK30、MDYZ、MDJK11和MDJK44分别属于暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、Bacillus paralicheniformis、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)、白网链霉菌(Streptomyces albireticuli)和白黄链霉菌(Streptomyces alboflavus)。采用选择性培养基筛选到溶磷细菌6株,解磷细菌4株,蛋白质降解菌11株和IAA产生菌10株。对MDJK10、MDJK30和MDYZ菌株进行了培养基优化,生长培养基的优化采用稀释涂布法计数,发酵培养基的优化采用牛津杯法检测抑菌活性。以豆芽汁培养基为基础培养基,通过单因素试验选择适宜的碳源、氮源和无机盐。单因素试验所用碳源为葡萄糖、蔗糖、乳糖、玉米粉、玉米淀粉和可溶性淀粉;所用氮源为豆粕、酵母粉、蛋白胨、尿素、(NH42SO4和NaNO3;所用无机盐为KH2PO4、K2HPO4、Mg SO4·7H2O、CaCO3、CuSO4·5H2O和FeSO4·7H2O。利用正交试验,确定最佳培养基配方。MDJK10最佳生长培养基:蔗糖2%,豆粕1.5%,CuSO4·5H2O 0.003%;最佳发酵培养基:玉米粉2%、蛋白胨1.5%、CuSO4·5H2O 0.003%。MDJK30最佳生长培养基:葡萄糖3%,Na NO3 2%,Fe SO4·7H2O 0.002%;最佳发酵培养基:蔗糖1%、NaNO3 2%、K2HPO4 0.3%。MDYZ最佳生长培养基:蔗糖1%、NaNO3 1%、MgSO4·7H2O 0.1%;最佳发酵培养基:玉米粉1%,酵母粉2%,Mg SO4·7H2O 0.3%。对MDJK30、MDJK11、MDJK44菌株进行了全基因组测序分析。Bacillus paralicheniformis MDJK30菌株的基因组是1条环状的染色体,基因组大小为4,352,468bp,GC含量为45.94%;含有4,363个基因,其中编码基因4,134个、RNA基因110个(包括24个rRNA基因,81个tRNA基因和5个ncRNA基因)、假基因119个。Antismash3.0.5分析结果显示,MDJK30基因组共含有11个次级代谢合成基因簇,包括4个已知功能基因簇和7个未知功能基因簇。Stretomyces albireticuli MDJK11菌株基因组为1条线性染色体,基因组大小为8,144,417bp,GC含量为72.82%;含有6,971个基因,包括73个tRNA基因和21个rRNA基因。Antismash3.0.5分析结果表明,MDJK11基因组共含有46个次级代谢合成基因簇,包括34个已知功能基因簇和12个未知功能基因簇。Stretomyces alboflavus MDJK44菌株基因组由1条线性染色体和2个线性质粒pSJK1和pSJK2组成;染色体大小为9,622,415bp,GC含量为72.09%,含有8,885个基因,包括68个tRNA基因和18个r RNA基因。Antismash3.0.5分析结果表明,MDJK44基因组共含有31个次级代谢合成基因簇,包括25个已知功能基因簇和6个未知功能基因簇;pSJK1大小为88,700bp,GC含量为67.46%,含有81个基因;pSJK2大小为256,434bp,GC含量为70.08%,含有285个基因,两个质粒上的大部分基因功能未知。
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