论文部分内容阅读
桑椹不但营养价值高,而且具有多种保健功能,被国家卫生部列入“既是食品又是药品”的名单,成为开发功能性食品的优质原料。桑椹含有丰富的花色素苷,是桑椹中的重要活性成分,也是天然色素的重要来源之一,花色素苷是广泛存在于植物中的水溶性天然色素,以其重要的生理和经济作用受到研究者们的关注。花色素苷合成的调控机理研究,对于植物花色素苷含量的提高、品质的创新等有重要科学意义。本研究以大十(黑色果实)和白玉王(白色果实)桑椹品种为材料,开展花色素苷合成中转录因子MYB的分离与生物信息学分析;明确不同品种、果实生长时期花色素苷合成结构基因和MaMYBs表达模式;研究桑椹花色素苷合成中MaMYB10的作用。探索调控桑椹花色素苷合成的新途径;有助于改良桑椹色泽,提高桑椹经济价值。主要研究结果如下:1不同桑椹品种、果实生长时期花色素苷含量变化采用CIRG色差系统用于桑椹外观色泽变化的量化评价。桑椹黑色‘大十’和白色‘白玉王’2个品种果实的CIRG值存在显著差异,成熟‘大十’品种的CIRG值为7.22、成熟‘白玉王’品种的CIRG值为3.24,‘白玉王’品种的CIRG值明显低于‘大十’品种。随着果实发育进程,黑色‘大十’的CIRG值呈上升趋势,颜色明显加深,与其总花色素苷含量变化一致;但白色‘白玉王’的CIRG值基本没有变化。采用HPLC,黑色‘大十’品种中检测到2种类型(矢车菊素-3-O-葡萄糖苷、矢车菊素-3-O-芸香苷),白色‘白玉王’品种中未检测到。随着果实发育进程,‘大十’品种的矢车菊素-3-O-葡萄糖苷含量呈增加变化,矢车菊素-3-O-芸香苷呈先增加后减少的趋势。结果表明桑椹总花色素苷含量的差异可能是造成不同品种色泽差异的主要原因,与桑树品种的遗传特性有关。2桑椹转录组测序及生物信息学分析通过构建桑椹转录组测序数据分析平台Illumina Hiseq4000,对桑椹的不同品种转录组测序数据进行了分析。共获得53184个测序深度大于100的SNP标记;共得SSR序列12082条,其中,单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸重复单元分别占35.96%、37.61%和22.97%。使用Trinity软件进行无参转录组测序数据拼接,得到32155个gene其平均长度956 bp,55883个transcrip其平均长度1161 bp;用GENScan软件预测gene编码区CDS,得到有效CDS 19238个,预测率为59.83%。GO功能分类注释中,获得了61个与花色素苷合成相关的基因。KEGG代谢途径富集分析中,找到桑椹花色素苷合成途径中的59个结构基因。与NR数据库比对,在桑椹转录组文库中发现了42个MYB基因(34个已命名,8个3桑椹花色素苷合成中转录因子MYB的全长cDNA克隆在成熟桑椹果实转录组数据库中,采用NR数据库BLAST,获得花色素苷合成相关的MYB转录因子(转录组中编号为comp16540_c0)为基础,利用RACE技术设计引物,获得MYB全长cDNA序列,长度1338 bp,5’端非翻译序列为245 bp,3’端非翻译序列为172 bp,翻译305个氨基酸,命名为MaMYB10。MaMYB10具有MYB转录因子的典型结构域,属于R2R3类MYB转录因子,通过NJ法构建进化树,发现其与已报道的其他物种(拟南芥、草莓、梨等)中参与花色素苷合成调控MYB转录因子具有较高的序列同源性。4桑椹花色素苷合成中MaMYBs和相关基因的表达分析根据成熟期桑椹果实转录组数据,采用KEGG pathway注释到4个MYB片段序列,克隆得到MaMYB10、MaMYB305、MaMYB5、MaMYB48家族成员,采用实时荧光定量技术(qPCR),大十品种的MaMYB10和MaMYB305表达显著高于白玉王品种,随着果实发育进程,MaMYB10和MaMYB305表达逐渐增强,与其花色素苷含量变化一致。但大十品种的MaMYB5和MaMYB48表达显著低于白玉王品种。桑椹花色素苷合成结构基因表达分析,结果显示,4个结构基因(MaCHS、MaDFR、MaANS和MaUFGT)在大十、白玉王品种中均有一定表达差异,其中大十品种的MaCHS、MaDFR、MaUFGT表达显著高于白玉王品种,随着果实发育进程,这3个结构基因表达增强,与其花色素苷含量变化一致;但大十品种的MaANS表达显著低于白玉王品种。转录因子MYB通过与bHLH和(或)WD40相互作用共同调控花色素苷代谢是高度保守的。通过成熟桑椹转录组数据库swissport des注释到1个bHLH(MabHLH75)和1个WD40(MaWD40-1)基因,qPCR表达分析表明,大十品种的MabHLH75表达显著高于白玉王品种,随着果实发育进程,MabHLH75表达逐渐增强,与其花色素苷含量变化一致。但大十品种的MaWD40-1表达显著低于白玉王品种。本研究表明MaMYB10和MaMYB305参与桑椹花色素苷的合成,且与结构基因MaCHS、MaDFR、MaUFGT及转录因子MabHLH75在不同品种不同生长时期的变化一致。