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目的：通过细胞感染模型，研究伤寒沙门菌质粒pRST98和沙门菌质粒毒力基因（Salmonella plasmid virulence gene，spv）对巨噬细胞（macrophage）自噬和凋亡的影响及其分子机制。方法：一.伤寒沙门菌质粒pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。以携带pRST98的伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi，S. typhi）野生株ST8、消除pRST98的突变株ST8-ΔpRST98和将pRST98经接合转移重新导入ST8-ΔpRST98所获得的回补株ST8-c-pRST98感染人巨噬细胞THP-1，以此作为感染模型，分别用自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin，RAPA）和NO合酶抑制剂L-硝基精氨酸甲酯（nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）进行干预。将细菌和细胞共培养30min后吸除上清，此时定为“0点”，加入含100μg/ml的阿米卡星（Amikacin, AMK）的培养液作用2h以去除胞外菌，然后将AMK浓度降为10μg/ml抑制从感染细胞中释放至培养液中的细菌生长，继续培养至各检测时间点。分别在细胞感染模型的0点、感染后2h和6h收集细胞或上清液。用流式细胞术（flowcytometry，FCM）检测巨噬细胞自噬蛋白微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein1light chain3，LC3）-II的表达和Sub-G1凋亡峰，透射电镜（transmission electron microscope，TEM）观察细胞超微结构的变化，Western blot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，比色法测定Caspase-3的活性，Griess法检测NO（nitric oxide）含量，ELISA法检测TNF-α含量，平板菌落计数法检测胞内活菌数。二.沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。由于伤寒沙门菌只感染人类的严格宿主特异性，缺乏理想的动物模型，为今后进一步在动物活体内研究pRST98上spv的功能，本部分实验使用鼠伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium，S. typhimurium）开展相应实验，以携带spv的鼠伤寒沙门菌野生株UF009和敲除spv的鼠伤寒沙门菌突变株UF110感染鼠巨噬细胞J774A.1，以此作为感染模型，并用p38抑制剂SB203580进行干预。细菌和细胞共培养1h后吸除上清，此时定为“0点”， AMK的应用同第一部分。分别在细胞感染模型的0点、感染后2h、6h和24h收集细胞或上清液进行相关指标的检测。用FCM检测巨噬细胞自噬蛋白LC3-II的表达和Sub-G1凋亡峰，Western blot法检测巨噬细胞自噬蛋白Beclin-1和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，Griess法检测NO的含量。结果：一.伤寒沙门菌质粒pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。1. FCM和Western blot检测自噬蛋白LC3-II和Beclin-1结果显示，细胞感染模型的0点，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞LC3-II（P <0.01）和Beclin-1的表达量均显著低于ST8-ΔpRST98组；感染后2h，各感染组细胞LC3-II（P>0.05）和Beclin-1的表达量未见明显差异。2. FCM检测Sub-G1凋亡峰结果显示，感染后2h，各感染组细胞凋亡率未见明显差异（P>0.05）；感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞凋亡率显著高于ST8-ΔpRST98组（P <0.01）。电镜结果与FCM检测结果一致，感染后2h，各感染组细胞均可见染色质边聚等凋亡改变，但各组细胞的凋亡现象未见明显差异；感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组凋亡细胞明显多于ST8-ΔpRST98感染组。Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2，亦发现感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞Bcl-2表达量显著低于ST8-ΔpRST98组。3.比色法检测Caspase-3活性结果显示，感染后2h，各感染组细胞Caspase-3活性未见明显差异（P>0.05）；感染后6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞Caspase-3活性高于ST8-ΔpRST98组（P <0.05）。4.细胞上清液中NO和TNF-α测定结果显示，感染后2h和6h，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞NO（P <0.01）和TNF-α（2h, P <0.01；6h, P <0.05）产生量均低于ST8-ΔpRST98感染组。而平板菌落计数法检测细胞内活菌数结果显示， ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞内活菌数高于ST8-ΔpRST98感染组（2h, P <0.05；6h, P<0.01）。5.用自噬诱导剂RARA干预后，ST8和ST8-c-pRST98感染组细胞的凋亡率（P<0.01）和细胞内活菌数降低（2h, P <0.05；6h, P <0.01），而ST8-ΔpRST98感染组未见明显变化（P>0.05）。6.用NO合酶抑制剂L-NAME干预后，ST8-ΔpRST98感染组细胞LC3-II表达量显著下降（P <0.01），凋亡率（P <0.01）和Caspase-3活性（P <0.05）上升，而ST8和ST8-c-pRST98感染组未见明显变化（P>0.05）。二.沙门菌质粒毒力基因spv对巨噬细胞自噬和凋亡的影响及分子机制研究。1. FCM和Western blot检测自噬蛋白LC3-II和Beclin-1结果显示，细胞感染模型的0点，UF009感染组细胞LC3-II（P <0.01）和Beclin-1的表达量均显著低于UF110感染组；感染后2h，UF009和UF110感染组细胞LC3-II（P>0.05）和Beclin-1的表达量未见明显差异。2.用p38的抑制剂SB203580干预后，细胞感染模型的0点，UF009感染组细胞LC3-II（P>0.05）和Beclin-1的表达量未见明显变化，而UF110感染组细胞LC3-II（P <0.01）和Beclin-1的表达量显著下降。3. FCM检测Sub-G1凋亡峰结果显示，感染后2h，UF009和UF110感染组细胞凋亡率未见明显差异（P>0.05）；感染后6h和24h，UF009感染组细胞凋亡率显著高于UF110感染组（P <0.01）。Western blot检测抗凋亡蛋白Bcl-2结果显示，感染后2h，UF009和UF110感染组细胞Bcl-2的表达量未见明显差异；感染后6h，UF009感染组细胞Bcl-2的表达量略低于UF110感染组，两组之间差异不显著；感染后24h，UF009感染组细胞Bcl-2的表达量显著低于UF110感染组。4.用p38的抑制剂SB203580干预后，FCM结果显示，感染后6h和24h，UF009感染组细胞凋亡率未见明显变化（P>0.05），而UF110感染组细胞凋亡率上升（P <0.05）；Western blot结果显示，感染后24h，UF009感染组细胞Bcl-2表达量未见明显变化，而UF110感染组细胞Bcl-2表达量显著下降。5. Griess法检测细胞上清液中NO结果显示，感染后2h、6h和24h，UF009感染组细胞NO产生量均显著低于UF110感染组（P <0.01）。6.用p38抑制剂SB203580干预后，各时间段UF009感染组细胞NO产生量未见明显变化（P>0.05），而UF110感染组细胞NO产生量显著降低（P <0.01）。结论：以上实验结果表明，伤寒沙门菌质粒pRST98在感染早期通过抑制巨噬细胞自噬抵抗杀菌作用，使细菌在细胞内的活菌数量增加，而在后期则诱导细胞凋亡。用自噬诱导剂RAPA干预细胞感染模型并激活自噬，能够减轻携带pRST98的伤寒沙门菌诱导的巨噬细胞凋亡。pRST98对巨噬细胞自噬和凋亡的影响与该质粒抑制细胞NO及TNF-α的产生有关。沙门菌质粒毒力基因spv能抑制巨噬细胞自噬并促进凋亡，用p38的抑制剂SB203580干预细胞感染模型能使敲除spv的突变株诱导的巨噬细胞自噬减弱而凋亡增强，说明spv的作用与p38信号通路密切相关。