研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)是成人颅内最常见的、恶性程度最高的原发恶性肿瘤,即使采用了在最大安全范围手术切除肿瘤的基础上辅以同步放化疗,仍然复发率高、预后差。虽然大样本临床数据已经证实在安全范围内手术切除肿瘤后在辅助放疗时加入替莫唑胺(temozolomide, TMZ)同步放化疗,GBM患者中位生存期及2年存活率较单纯放疗明显提高,但患者的中位生存期仍仅约14.6月,而肿瘤细胞对TMZ的抵抗是患者预后差的主要原因之一。尽管目前投入了大量关于GBM对TMZ耐药的研究,但TMZ具体的耐药机制仍未阐述清楚。目前对TMZ耐药机制以单个蛋白的研究为主,尽管也有大量的蛋白组学研究来阐述TMZ耐药机制,但仍未明确。蛋白质组学(Proteomics)是在大规模、高通量、系统化的水平上研究蛋白质的特征,它包括了蛋白的表达水平,蛋白翻译后的修饰,蛋白与蛋白之间的相互作用等,从而得到对蛋白质水平上关于疾病发生,细胞代谢等过程的整体而全面的了解。当然,这里的蛋白质是指一个细胞或组织中由基因组表达的全部蛋白质。然而,全部蛋白质的组成是极其复杂的,直接对其进行蛋白质组学分析,往往会丢掉很多蛋白信息。同时,随着研究的深入,人们发现全蛋白质组是处于动态变化的,存在时间上的特殊性和空间上的多样性,在不同的环境影响下,同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期,它的蛋白质组也是不断变化的。因此,为了更好地了解这一动态的变化过程,蛋白质组学中提出了一个新的领域一亚细胞蛋白质组学(subcellular proteomics)。亚细胞蛋白质组学的研究不仅可以减少全蛋白组分析的复杂性,还可以富集低丰度蛋白,完善全细胞蛋白质组,加深对亚细胞组分的结构和功能理解,可以更灵敏的反映病理因素造成的一些蛋白质的量变、质变和蛋白的迁移情况,有助于人们对生命活动深入而全面的认识。分析细胞在不同状态下亚细胞蛋白质组的差异表达蛋白,并研究其功能,为我们寻找特性生物标记,探究相关机理提供了一种强有力的手段。因此,本文我们采用亚细胞蛋白质组学的研究策略来探讨GBM对TMZ的耐药机制。回顾既往文献,TMZ耐药机制的研究多集中于对耐药株(自然耐药或诱导耐药)和敏感株进行比较,对GBM细胞从药物敏感向不敏感转换过程的研究较少,而我们临床中发现,GBM对TMZ的耐药是在TMZ的诱导下逐步发生的。本实验室前期采用TMZ(200 μM)持续刺激人脑胶质母细胞瘤细胞细胞系U87,发现1周(W)时,绝大多数细胞已经死亡,但仍有少量细胞存活。这些存活的细胞形态学发生显著变化,胞体、胞核变大,异型性增加,更加显著的变化表现为细胞向各个方向伸出多个细长伪足。随着TMZ作用时间的延长,细胞又逐渐恢复至TMZ处理前培养的细胞形态。这一现象提示我们GBM细胞受到TMZ持续作用1 W后仍存活并发生显著形态学变化的阶段,是其由敏感向不敏感转化的关键时期,也是与TMZ耐药的发生密切相关的时期。因此,我们选择该状态下的细胞,应用亚细胞蛋白组学的方法,筛选差异蛋白,探讨GBM耐药机制,同时以期发现新的能够增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐药的生物标志物。因此,本研究以胶质母细胞瘤U87细胞系为研究对象,TMZ持续作用U87细胞1W后提取胞浆和胞核蛋白,采用亚细胞蛋白质组学的方法L abel-free法识别、定量蛋白表达的改变,筛选出差异蛋白,然后再通过生物信息学的方法,采用GO注释富集分析,KEGG通路注释及富集分析,聚类分析对筛出蛋白进行显著性差异分析,找出可能与TMZ耐药密切相关的差异蛋白,以期揭示GBMTMZ耐药机制以及发现新的能够增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐药的生物标志物,为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的理论依据。而为了下一步深入探讨筛选出的差异蛋白的功能,良好的细胞模型是后续研究的基础,原代细胞因性质和特点上更接近于肿瘤在人体的原始状态,因此是目前研究肿瘤致病机制、放化疗抵抗和肿瘤细胞的分子生物学特性的最常用的工具。然而,传统的胶质瘤原代细胞培养方法耗时长,操作繁琐,成功率低,因此我们对其进行了改良,成功培养了足量的原代胶质瘤细胞,为下一步细胞水平验证差异蛋白功能提供了良好的工具。第一部分：TMZ作用U87细胞1W后亚细胞蛋白组学识别和定量差异蛋白目的：采用亚细胞蛋白组学label-free法识别和定量TMZ持续作用U87细胞1周后胞浆蛋白和胞核蛋白差异表达蛋白,筛选与GBM TMZ耐药密切相关的差异蛋白及通路,探讨TMZ的耐药机制,以期发现新的能够增加TMZ敏感性或抑制TMZ耐药的生物标记物。方法：取生长状态良好的U87细胞,加入TMZ(200μM)持续作用1周,使用二甲基亚砜(DMSO)持续作用1周作为对照组,细胞形态观察及检测以上两组的存活细胞数及细胞活力。收集以上各组条件下的U87细胞进行核质分离,提取胞浆蛋白和胞核蛋白样品,考马斯亮蓝法对各组蛋白定量,采用蛋白质印迹法、Vestern Blot,兼容质谱银染法及质谱分析验证胞浆蛋白和胞核蛋白纯度及处理因素的有效性(所有实验生物学重复3次)。收集生物学重复三次的胞浆蛋白和胞核蛋白样品,采用亚细胞蛋白组学Label-free法识别和定量各组细胞胞浆蛋白与胞核蛋白,以蛋白含量变化倍数>+/-2.0且P value<0.05为筛选标准,筛选差异蛋白,对TMZ组和DMSO组胞浆差异蛋白和胞核差异蛋白在GO功能注释及KEGG通路注释基础上,分别进行GO富集分析和KEGG富集分析,找出与TMZ密切相关的差异蛋白。结果：TMZ(200μM)持续作用U87细胞系1周后,U87细胞形态发生显著变化,细胞突起变长,细胞胞体变大、变长。实验组U87细胞活力明显下降,与DMSO组比较,存活细胞数也显著减少。与前期实验结果细胞表型相符。各组U87细胞核质分离后胞浆蛋白和胞核蛋白定量准确,蛋白总量满足后续实验需求。蛋白质印记法Western Blot结果显示,各组胞浆蛋白中基本无胞核蛋白表达,胞核蛋白中无胞浆蛋白表达,蛋白间没有相互污染,核质分离成功。兼容质谱银染法结果显示,蛋白质条带清晰,实验组和对照组间蛋白表达差异明显。质谱分析显示组内样品信号峰的分布以及质谱信号强度相似,而组间样品信号峰的分布以及质谱信号强度差异明显。亚细胞非标记定量蛋白组学Label-free法识别和定量各组细胞胞浆蛋白与胞核蛋白表达的改变后,从原始数据中质谱定性到的蛋白质共计3910个。按照筛选标准,共筛选出差异蛋白304种,其中,TMZ组和D MSO组胞浆蛋白筛出差异蛋白数目148个,上调蛋白数量90种,下调蛋白数量58种。胞核蛋白筛出差异蛋白156个,上调蛋白数量76种,下调蛋白数量80种。通过对差异蛋白进行GO富集分析发现,在胞浆蛋白中上调的差异蛋白在细胞内定位、分子功能及参与的生物学过程有集中趋势,细胞内定位主要分布在核糖体上,从分子功能看,其主要功能与核糖体结构组分相关,而从参与的生物学过程看,主要集中在参与翻译及翻译后的修饰过程；而在胞浆蛋白中下调的差异蛋白在细胞内定位、分子功能及参与的生物学过程上未表现出集中趋势。在胞核蛋白中上调差异蛋白在细胞内定位及参与的生物学过程及分子功能上有集中趋势,从细胞内定位分析看上调差异蛋白主要集中在细胞核上,而分子功能主要与DNA的复制、转录相关,主要参与核酸、含碱基化合物及染色质重塑的过程；在胞核蛋白中下调的差异蛋白在细胞定位、分子功能及参与的生物学过程也未出现明显的集中趋势且与TMZ的作用没有明显的相关性。差异蛋白KEGG通路富集分析发现在胞浆蛋白中,上调的差异蛋白主要RNA转运信号通路、Ribosome信号通路及Ribosome biogenesis in eukaryotes信号通路密切相关。在胞核蛋白中,上调的差异蛋白主要与mismatch repair信号通路,Transcriptional misregulation in cancer信号通路及Spliceosome信号通路有关。在胞浆蛋白和胞核蛋白中下调的差异蛋白中,我们发现二者均与PI3K-Akt signaling pathway信号通路有关。此外,在胞核蛋白中下调的差异蛋白还与MicroRNAs in cancer信号通路相关。通过GO富集分析及KEGG通路富集分析,我们共筛选出5种可能与TMZ密切相关的差异蛋白。结论：本实验应用亚细胞定量蛋白质组学Label-free技术研究TMZ持续作用U87细胞1周后胞浆蛋白和胞核蛋白的差异表达情况,筛选出差异蛋白,通过对差异蛋白GO功能富集分析,我们发现,胞浆蛋白中上调的差异蛋白主要定位于核糖体上,参与翻译和翻译后修饰过程,这提示我们,翻译及翻译后修饰过程可能与TMZ耐药关系密切,值得下一步深入探讨,而在下调的差异蛋白中,在功能、定位及参与生物学过程并未发现有集中趋势,因此未作进一步分析。在胞核蛋白中上调的差异蛋白在细胞内定位、分子功能及参与的生物学过程均有集中趋势,差异蛋白主要定位在细胞核上,而分子功能主要与DNA的复制、转录相关,主要参与核酸、含碱基化合物及染色质重塑的过程。这一个结果与TMZ引起DNA损伤后出现损伤修复相符,提示我们胞核蛋白的变化与TMZ耐药的产生关系可能更为密切；在胞核蛋白中下调的差异蛋白在细胞定位、分子功能及参与的生物学过程也未出现明显的集中趋势且与TMZ的作用没有明显的相关性,因此,在下一步分析中,未对胞核蛋白中下调的差异蛋白进行深入探讨。同时对差异蛋白的可能参与的代谢与信号通路进行KEGG通路富集分析,分别选取了可能与TMZ耐药密切相关的信号通路,通过对参与这些通路的差异蛋白筛选,结合GO功能富集分析,我们共筛选出5种可能与TMZ密切相关的差异蛋白,为进一步探讨TMZ耐药机制奠定了基础。第二部分：改良传统酶消化法人脑胶质瘤原代培养目的：探索一种改良的酶消化法人脑胶质瘤细胞原代培养的方法,为后期实验在原代细胞水平验证蛋白功能提供良好的工具。方法：基于文献结合个人经验,改良既往文献报道的酶消化法胶质瘤原代细胞培养方法,对32例不同级别的胶质瘤进行原代细胞培养,通过倒置相差显微镜观察肿瘤细胞的形态学特点；传代时采用差速贴壁法对原代细胞进行纯化；通过细胞免疫荧光对原代细胞进行鉴定；通过细胞增殖实验(CCK法)绘制生长曲线,研究体外培养细胞的增殖情况,取对数生长期细胞予以冻存,适时复苏,了解细胞冻存效果及复苏后细胞形态及增殖变化。结果：改良的培养方法成功培养28例,4例失败,成功率为87.5%；培养成功的细胞贴壁生长,细胞状态稳定,形态各异,生长状态良好,并可传代；细胞免疫荧光显示胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达阳性,证明培养的细胞为胶质瘤细胞；细胞增殖实验(CCK法)显示细胞在体外增殖活跃,肿瘤病理级别越高,细胞增殖能力越强。原代细胞复苏后细胞生长状态良好,细胞形态较冻存前无明显变化,细胞增殖活跃,细胞冻存成功。结论：改良的酶消化法人脑胶质瘤细胞原代培养的方法具有简单,高效,成功率高等优点,能够为后期实验提供良好的保证。