第一部分 Toll样受体2和4在氧诱导的视网膜新生血管发生中作用及其机制　　研究背景：早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity，ROP）是造成婴幼儿视力丧失的主要原因，其主要的病理改变是病理性增生的视网膜新生血管（ retinal neovascularization，RNV）。近年研究发现，除早产、低出生体重以及吸氧外，感染与炎症可能作为新的致病途径参与ROP的发生发展。　　Toll样受体（toll like receptors，TLRs）是一类重要的固有免疫模式识别受体，在多种免疫细胞中表达并精细调控机体的固有免疫应答反应和炎症反应。有关TLRs影响病理性新生血管形成的相关研究已经崭露头角。本研究组前期工作证实，TLR4的激动剂脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的炎症可加重ROP动物模型中RNV的生成，并促进视网膜小胶质细胞的活化，提示TLR4介导活化的MG参与调控的炎症反应在RNV的发生发展中具有重要意义。而目前对其他的TLRs是否参与RNV的生成及其具体机制尚不清楚。　　目的：探讨TLR2和TLR4对RNV生成的影响，揭示其参与RNV发生发展的机制。　　方法：　　1. OIR模型建立及实验分组新生C57BL/6J小鼠于生后随机分为常氧组、OIR组、OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组。常氧组小鼠则始终置于正常空气中饲养，后三组在第7天（P7）至P12与母鼠共同置于体积分数（75±2）％高氧氧箱中饲养，于 P12返回正常空气，OIR+Pam3CSK4组和 OIR+LPS-EB组分别于 P12腹腔注射Pam3CSK4和LPS-EB，常氧组和OIR组腹腔注射等量PBS。　　2．视网膜铺片染色在第17天致死剂量麻醉动物后，取小鼠视网膜行 Lectin染色、铺片，以观察无血管区面积和新生血管生长情况。　　3. Western-blot法检测小鼠视网膜中TLR2和TLR4的表达水平。P17天提取各组小鼠视网膜，使用Western-blot检测TLR2/TLR4和NF-κB的表达水平。　　4.免疫荧光法检测MG表达TLR2和TLR4的情况以及MG表达VEGF、IL-1β和TNF-α的水平。使用小鼠视网膜冰冻切片进行CD11b与TLR2/TLR4的共染，计数视网膜中CD11b与TLR2/TLR4共标的细胞数量，反映MG表达TLR2/TLR4的水平。使用小鼠视网膜冰冻切片进行CD11b与VEGF/IL-1β/TNF-α的共染，通过计数视网膜中 CD11b与 VEGF/IL-1β/TNF-α共标的细胞数量，反映 MG表达VEGF/IL-1β/TNF-α的水平。　　5.组织ELISA检测视网膜中 VEGF、IL-1β和TNF-α等相关细胞因子的表达水平。　　6. Transwell法检测TLR2和TLR4激活的MG对脉络膜-视网膜血管内皮细胞迁移的影响。　　结果：　　1.视网膜无血管区面积和新生血管生长情况 P17时视网膜铺片 Lectin染色显示，常氧组小鼠视网膜已完全血管化，血管发育良好，分布均匀；OIR组、OIR+Pam3CSK4组以及 OIR+LPS-EB组小鼠视网膜后极部存在无血管区和新生血管，无血管区面积百分比分别为（15.78±1.44）%、（13.45±0.59）%和（18.47±1.32）%，新生血管面积百分比分别为（1.77±0.19）%、（2.62±0.20）%和（3.29±0.85）%。OIR+Pam3CSK4组无血管区面积小于OIR组（P＜0.05），OIR+LPS-EB组的无血管区面积大于OIR组（P＜0.05）。OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组新生血管面积均大于OIR组（P＜0.05）。　　2. MG激活情况免疫荧光结果显示P17天，常氧组视网膜中未见激活状态的MG，在 OIR组可见大量激活的MG，为（74.83±4.17）个/5mm，OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组中呈激活状态的MG数目明显增多，分别为（82.17±4.96）个/5mm和（95.50±4.96）个/5mm（P＜0.05）。　　3. TLR2和TLR4表达水平 Western-blot结果显示，常氧组视网膜中TLR2、TLR4和NF-κB表达量较低，分别为（0.60±0.36，0.87±0.35，0.60±0.17），OIR组中表达均增高，分别为（1.10±0.45，2.5±0.70，1.6±0.40），差异均有统计学意义（P＜0.05）。OIR+Pam3CSK4组TLR2/NF-κB水平高于OIR组，分别为（1.57±0.67）和（2.90±0.45），差异均具有统计学意义（P＜0.05）。OIR+LPS-EB组TLR4/NF-κB表达水平高于OIR组，分别为（3.40±0.56）和（3.9±0.365）（P＜0.05）。　　4. MG表达TLR2/TLR4情况常氧组视网膜中无表达TLR2/TLR4的MG，OIR组和OIR+Pam3CSK4组视网膜中表达TLR2的MG数量分别为（27.67±5.75）个/5mm和（45.00±5.59）个/5mm（P＜0.05）。OIR组和OIR+LPS-EB组视网膜中表达TLR4的MG数量分别为（28.17±6.24）个/5mm和（49.50±6.38）个/5mm（P＜0.05）。　　5. MG表达 VEGF、IL-1β和 TNF-α的水平 P17天时正常氧视网膜中共表达CD11b和VEGF/IL-1β/TNF-α的细胞极少，分别为（1.17±0.75）个/5mm、0个/5mm和0个/5mm，OIR组、OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组均有较多呈黄色荧光的双标阳性细胞。OIR组、OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组分泌VEGF的MG数分别为（28.5±3.02）个/5mm、（37.1±2.64）个/5mm和（44.50±8.78）个/5mm，与OIR组相比，后两组MG数增多（P＜0.05）；三组分泌IL-1β的MG数分别为（16.0±3.46）个/5mm、（22.17±1.17）个/5mm和（24.1±6.49）个/5mm，与 OIR组相比，后两组MG数增多（P＜0.05）；三组分泌 TNF-α的MG数分别为（23.0±2.83）个/5mm、（21.50±3.27）个/5mm和（33.83±6.08）个/5mm，与OIR组相比，OIR+Pam3CSK4组MG数量未增加（P＞0.05），OIR+LPS-EB组增加（P＜0.05）。　　6.视网膜中VEGF、IL-1β和TNF-α表达水平组织ELISA结果显示，常氧组视网膜中IL-1β和TNF-α水平较低，分明别为（5.04±0.25）pg/ml和（4.06±0.17）pg/ml， OIR组、OIR+Pam3CSK4组和OIR+LPS-EB组IL-1β表达水平显著增高（P＜0.05），分别为（14.15±1.37）pg/ml、（22.28±5.27）pg/ml和（27.29±4.72）pg/ml；三组TNF-α表达水平分别为（5.12±00.15）pg/ml、（5.30±0.05）pg/ml和（6.25±0.41）pg/ml，与OIR组相比，OIR+Pam3CSK4组水平未增高（P＞0.05），OIR+LPS-EB组水平增高（P＜0.05）。　　7. TLR2和TLR4激活的MG对视网膜血管内皮细胞迁移的影响 Transwell结果显示，无激动剂刺激的MG组，迁移到小室下的视网膜血管内皮细胞为（115.30±14.12）个，TLR2和 TLR4激活的MG组能够促进更多的视网膜血管内皮细胞迁移，数量分别为（159.33±15.51）个和（256.21±14.55）个，均多于无激动剂刺激的MG组（P＜0.05）。　　结论：TLR2/TLR4可能通过激活MG中相关的下游信号通路NF-κB，促进或调节VEGF、IL-1β和TNF-α的表达，从而促进新生血管生成。　　第二部分小胶质细胞对氧诱导视网膜病变中血管化进程的影响　　研究背景：视网膜缺血性疾病包括视网膜血管阻塞、急性青光眼、糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）和早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity， ROP）等，视网膜循环障碍介导的细胞缺氧相关的视网膜损伤是导致视力丧失的重要原因。鼠类OIR模型能够很好地模拟视网膜缺血过程，在相关研究领域得到广泛应用。我组前期研究以及相关文献均证实，在OIR模型中出现视网膜MG激活和数量增加，但尚不清楚MG在该模型中的具体作用，有关MG激活的具体机制也有待深入研究。　　目的：探讨小胶质细胞在视网膜血管化进程中的作用及其机制。　　方法：　　1. OIR模型的建立与实验分组实验分为常氧组、OIR组和OIR+minocycline组，建模方法同上，OIR+minocycline于P7至P16天每天腹腔注射minocycline（45mg/kg），其余两组注射等量PBS。　　2.视网膜铺片染色检测无血管区面积。分别于P12、P14、P17和P21天致死剂量麻醉小鼠后，取小鼠视网膜 Lectin染色、铺片，荧光显微镜下记录视网膜血管情况，软件分析无血管区面积。　　3.免疫荧光法观察视网膜中MG的分布、数量以及增殖情况。P17和P21天，取视网膜进行Iba1及Lectin染色，观察MG在视网膜中的分布情况，以及其与血管的分布关系。分别制作OIR组和OIR+minocycline组P12、P14、P17和P21天视网膜冰冻切片并进行 Iba1染色，计数每5mm视网膜中长度中 MG数量。OIR组和OIR+minocycline组小鼠分别于 P12至 P21天每日留样制作冰冻切片，进行 CD11b和Ki67共染，观察视网膜MG增殖情况。　　4. TUNEL染色检测MG凋亡情况。OIR组小鼠分别于P12、P14和P17天制作冰冻切片，进行Iba1和TUNEL共染，观察视网膜MG凋亡情况。　　5.液相芯片法检测视网膜中相关炎症因子的水平。三组小鼠均于P7、P9、P12、P14和P17天提取视网膜提取蛋白，检测视网膜中IL-4、IL-10、IL-1β和TNF-α的蛋白水平。　　结果：　　1.视网膜无血管区面积 OIR组和OIR+minocycline组小鼠在P12、P14及P17天均可见视网膜后极部存在无血管区，OIR组此3天的无血管区面积百分比分别为（25.83±1.47）%、（22.17±1.60）%和（13.50±2.43）%，OIR+minocycline组分别为（30.33±2.50）%、（27.17±1.72）%和（17.50±3.39）%，统计两组无血管区面积，发现各天次OIR+minocycline组视网膜无血管区面积大于OIR组（P＜0.05）。P21天时OIR组视网膜中尚残存部分无血管区，而OIR+minocycline组的视网膜无血管血管化较为完全，且中周部的视网膜新生血管退化较为迅速。　　2. MG分布在P17时在无血管区和血管交界区以及新生血管区大量聚集，分化正常的血管中多为未激活状态的MG，使用minocycline抑制了浅层MG的大量聚集和激活，对深层 MG的活化状态影响较小。P21时可见 OIR+minocycline组较 OIR组聚集了更多的MG，血管化情况也更好。　　3. MG数量两组在P12、P14、P17和P21天时OIR组和OIR+minocycline组均可见视网膜神经节细胞层和内丛状层有大量活化的MG，内核层和外丛状层也可见少量活化的MG。OIR组此4天的MG数量分别为（76.00±8.60）个/5mm、（59.33±3.27）个/5mm、（78.50±5.79）个/5mm和（66.33±5.24）个/5mm，OIR+minocycline组分别为（46.50±5.24）个/5mm、（39.33±4.76）个/5mm、（46.17±4.96）个/5mm和（72.67±5.39）个/5mm。OIR+minocycline组在P12、P14和P17天时视网膜MG数量少于OIR组（P＜0.05）。P21天时OIR+minocycline组MG数量高于OIR组（P＜0.05）。　　4. MG凋亡情况在OIR小鼠中，MG在P12和P14天时的凋亡现象最显著，这可能是造成MG在P12~P14天数量减少的原因之一。　　5. MG增殖情况视网膜中MG增殖现象在P12至P14天不明显，而在P16和P17天时视网膜MG增殖较多，OIR组达到（27.17±5.27）个/5mm和（21.83±4.26）个/5mm，OIR+minocycline组为（16.83±5.12）个/5mm和（15.50±1.87）个/5mm， OIR+minocycline组增殖的MG数量少于OIR组（P＜0.05）。在P19天OIR组增殖的MG数（2.67±1.51）个/5mm，少于OIR+minocycline组（6.33±2.42）个/5mm（P＜0.05）。P21天时两组MG增殖均不明显。　　6.细胞因子浓度 P9、P12、P14和 P17天OIR组 IL-10、IL-1β和 TNF-α在OIR中表达均高于常氧组。OIR组IL-10在P9~P12天水平呈现升高趋势，在P12天达到（43.45±3.06）pg/ml，其后下降，在P14和P17天时分别为（34.45±2.67）pg/ml和（24.49±2.89）pg/ml。Minocycline能够促进P14和P17天IL-10的表达，分别为（48.83±2.69）pg/ml和（36.54±2.56）pg/ml，与 OIR组相比均增高（P＜0.05）。OIR组 IL-1β和 TNF-α均在 P17天时达到最高水平，分别为（36.51±2.27）pg/ml和（5.12±0.09）pg/ml。OIR+minocycline组P17天IL-1β和TNF-α的表达量分别为（16.70±1.56）pg/ml和（4.76±0.10）pg/ml，均低于OIR组（P＜0.05）。IL-4表达未见三组未见明显表达变化。　　结论:　　视网膜无血管区的血管化进程与激活状态的MG数量呈正相关。Minocycline能抑制MG的激活和增殖，解除minocycline的抑制作用后，MG增殖和激活增多，加快视网膜血管化进程。Minocycline还可能通过抑制MG向M1型分化，促进M2型的分化，从而减慢视网膜血管化进程。