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朊病毒病,是一类可感染包括人类在内多种哺乳动物的致死性神经退行性疾病,又称可传播性海绵状脑病(Transmissible spongiformencephalopathies,TSEs)。具有感染性和复制能力的异常朊蛋白(Prpsc)的沉积被认为是朊病毒病的主要致病原因,因此蛋白降解系统的异常改变在朊病毒病的发生、发展过程中就显得尤为重要。 自噬是细胞吞噬自体胞质、衰老细胞器、错误折叠蛋白以及病原体,然后将其降解成氨基酸重新再利用的生物过程,整个过程包括起始、延伸、成熟和降解几个阶段。自噬主要受哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target ofrapamycin,mTOR)依赖性通路和非mTOR依赖性通路以及一些蛋白激酶的调节。单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、Unc样激酶1(Unc-like kinase1,ULK1)是调节自噬的重要激酶,可以诱导自噬的发生。有研究表明,ULK1的第555位氨基酸-丝氨酸555(Ser555)是正向调节自噬的一个重要磷酸化位点,而抑制性位点Ser757受mTOR的调控,负调节自噬。本课题研究了朊病毒感染后AMPK-ULK1信号通路调节自噬的情况。 本研究主要从体内和体外两方面展开研究。体内研究发现:羊瘙痒因子263K感染的仓鼠脑组织中AMPKα1/2和172位苏氨酸磷酸化的AMPKα(p-AMPK(Thr172))、ULK1和555位丝氨酸磷酸化的ULK1(p-ULK1(Ser555))的蛋白表达水平相比正常仓鼠脑组织有显著的升高,而757位丝氨酸磷酸化的ULK1(p-ULK1(Ser757))的表达水平却有明显下降。免疫组织化学实验结果显示:263K感染的仓鼠脑组织切片中小脑、皮质、脑干部位表达AMPKα1/2、p-AMPK(Thr172)、ULK1和p-ULK1(Ser555)阳性信号的细胞都有明显的增加;而其小脑部位表达p-ULK1(Ser757)阳性信号的细胞有明显的减少,皮质和脑干部位几乎检测不到阳性细胞。263K感染的仓鼠脑组织匀浆中AMPK上游肝激酶B1(liver-kinase B1,LKB1)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin dependent protein kinaseⅡ,CAMKⅡ)的蛋白水平出现显著的降低。并且AMPK、ULK1、p-AMPK、p-ULK1和AMPK上游调节激酶在263K感染后的仓鼠脑组织中表达水平的变化都呈现出明显的时间依赖性。 体外研究主要是利用羊瘙痒因子chandler株感染的SMB-S15细胞和经戊聚糖硫酸酯治疗后康复的SMB-PS细胞为研究对象,进行AMPK-ULK1信号通路的研究。结果显示:SMB-S15细胞中LC3-Ⅱ的蛋白表达水平比SMB-PS细胞有明显增加,而泛素结合蛋白P62(Ubiquitin-conjugates protein62,P62/SQSTM1)蛋白水平出现显著下降。并且免疫荧光双染实验发现:SMB-S15细胞中出现明显的LC3Ⅱ阳性信号的聚集,而在SMB-PS细胞中只是有少量弥散的点状信号存在。结果表明,SMB-S15细胞中自噬流激活。同时,实验结果显示:SMB-S15细胞中p-AMPK(Thr172)、ULK1和p-ULK1(Ser555)的表达水平都有显著升高,但AMPKα1/2和p-ULK1(Ser757)的表达水平在两种细胞间几乎没有差异;SMB-S15细胞中mTOR的蛋白水平比SMB-PS细胞出现明显的降低,而正调节自噬的Ⅲ类PI3K复合物的核心蛋白BECN1只是出现微弱的下降。LKB1和CAMKⅡ的表达水平在SMB-S15细胞中也出现明显的升高,但在SMB细胞系中检测不到CAMKⅡ-β的表达。瞬时转染siRNA敲降ULK1后,SMB-S15细胞中自噬小体标志物LC3Ⅱ表达降低,表明在朊病毒感染的细胞中ULK1参与了自噬的活化。 本研究显示,朊病毒感染的动物和细胞模型中,AMPK-ULK1自噬调节通路参与了朊病毒感染引起的自噬激活。