第一部分Prohibit in在糖基化低密度脂蛋白诱导的内皮细胞凋亡中的作用研究研究背景目前,随着生活水平的提高和饮食结构的变化,糖尿病(diabetes mellitus, DM)患者日益增多。糖尿病带来的长期的高血糖和代谢紊乱会导致严重的并发症。糖尿病血管并发症主要包括大血管并发症和微血管并发症,是糖尿病患者致死或致残的主要原因之一。糖尿病是心肌梗塞、卒中的主要危险因素之一,同时也是慢性肾病的一大危险因素。糖尿病血管并发症不仅严重影响着糖尿病患者的生活质量和生存期限,也给国家和社会带来巨大的经济损失。因此,探索糖尿病血管并发症的发病机制和寻找有效的治疗方法是目前糖尿病研究的当务之急。高血糖和血脂异常是糖尿病的两大特点。高血糖引发血浆或组织中蛋白的非酶糖基化作用,产生不可逆的糖基化终末产物(glycation end-products, AGEs)。低密度脂蛋白(low-density lipoproteins, LDL)是血液中胆固醇的主要载体,LDL水平升高是已知的冠心病危险因素。糖尿病患者体内持续的高血糖状态使LDL产生糖基化反应,已有证据显示,糖尿病患者血浆中糖基化LDL的水平明显增高,这也成为糖尿病患者高发动脉粥样硬化的主导因素之一。血管内皮是位于血管管腔和血管壁之间的阻隔血流和其他组织的单细胞屏障,内皮损伤是动脉粥样硬化的第一步。在动脉粥样硬化等病理状态下,内皮细胞被激活,其屏障作用受损,引起血管炎症,进而导致斑块形成。近年来,绝大多数研究围绕着糖基化LDL在促进内皮细胞血栓形成、脂质沉积和促炎症等方面的作用,对于糖基化LDL是否能引起内皮细胞凋亡却鲜有研究。抑制素(prohibitins,PHBs)是一类具有高度同源性的蛋白,主要存在于线粒体内膜上。PHBs有两个同系物：Prohibitin (PHB,也被称为PHB1)和prohibitin 2 (PHB2),两者形成一个大的蛋白复合体,发挥多种与线粒体相关的生物功能。其中,PHB在调控细胞周期、细胞分化、细胞凋亡、细胞衰老等多种生物进程中起关键作用。我们前期的研究发现PHB与AGEs对内皮细胞的损伤有关联,本部分将进一步研究PHB、糖基化LDL和内皮细胞凋亡的内在联系。同时,我们利用天然药物葡萄籽原花青素B2 (grape seed procyanidin B2, GSPB2)进行干预,研究其与以上三者的相互作用。GSPB2是迄今为止发现的最有效的天然类抗氧化药物之一,具有多种生物活性,但其是否能对抗糖基化LDL损伤尚不明确。如果我们能寻找到GSPB2对抗糖基化LDL损伤的证据,将对糖尿病血管并发症的预防和治疗有重要的意义,对其有效药物的研发有极大的帮助。研究目的1.研究糖基化LDL对内皮细胞增殖和凋亡的影响以及GSPB2的保护作用。2.研究PHB蛋白在糖基化LDL介导的细胞凋亡中的作用,以及GSPB2与两者的相互作用。研究方法1.采用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVEC)作为细胞模型。正常对照组细胞(CC组)不做处理,损伤组细胞(glyLDL组)用50μg/ml糖基化LDL刺激HUVEC48小时,天然药物组细胞(glyLDL+GSPB2组)先用lOμmol/ml GSPB2预孵育2小时,再加入50μg/ml糖基化LDL刺激HUVEC48小时。然后用CCK-8法、TUNEL法检测HUVEC细胞的增殖率和凋亡率,用透射电镜观察各组之间细胞超微结构的改变,Western Blot检测PHB蛋白的表达。2.构建PHB过表达质粒和干扰siRNA,转染入细胞。空质粒组细胞(glyLDL+V组)为转染空载体pEGFP-C1的HUVEC,用50μg/ml糖基化LDL刺激48小时；过表达组细胞(glyLDL+VP组)为转染PHB过表达质粒的HUVEC,用50μg/ml糖基化LDL刺激48小时；阴性对照组细胞(NC组)为转染阴性对照siRNA的HUVEC;干扰组细胞(siPHB组)为转染PHB siRNA的HUVEC;干扰+天然药物组(siPHB+GSPB2组)为转染PHB siRNA的HUVEC,用10μmol/ml GSPB2孵育48小时。CCK-8法、TUNEL法检测HUVEC细胞的增殖率和凋亡率,用透射电镜观察各组之间线粒体超微结构的改变,Western Blot检测转染效率,以及Bax/Bcl-2比值、p-Akt的变化。研究结果1。糖基化LDL和GSPB2对HUVEC细胞增殖率的影响与CC组细胞相比较,经50μg/ml糖基化LDL刺激48小时后,HUVEC增殖率降低了近一半(p<0.05)；而先用10μmol/L GSPB2将HUVEC细胞预孵育2小时后,再加用50μg/ml糖基化LDL刺激48小时,其细胞增殖率的降低得到明显改善(p<0.05)2.糖基化LDL和GSPB2对HUVEC细胞凋亡的影响与正常细胞相比较,glyLDL组HUVEC细胞凋亡率大大提高(p<0.05)且细胞核呈现固缩、断裂的形态,凋亡小体出现；而glyLDL+GSPB2组细胞凋亡明显减轻(p<0.05)。3.糖基化LDL和GSPB2对HUVEC细胞线粒体超微结构的影响CC组HUVEC具有正常形态的线粒体,可见规则的板层状嵴；glyLDL组的部分细胞线粒体的板层状嵴结构消失,取而代之的是线粒体中出现囊泡状或高密度状结构；glyLDL+GSPB2组中线粒体的异常病变明显减轻。4.糖基化LDL和GSPB2对HUVEC细胞PHB表达的影响Western Blot检测发现,glyLDL组PHB蛋白表达量较CC组显著降低(p<0.05),而glyLDL+GSPB2组PHB蛋白的表达量明显升高(p<0.05)。5.PHB过表达质粒和siRNA的转染效率PHB过表达质粒和siRNA转染入HUVEC细胞24小时及48小时后,VP组PHB的蛋白表达量显著提升,超过2倍(p<0.05),而V组PHB的蛋白表达量较CC组无明显改变；siPHB组PHB的蛋白表达量下降60%以上(p<0.05),而NC组PHB的蛋白表达量较CC组无明显改变。6.PHB过表达质粒和siPHB对HUVEC细胞增殖率的影响相比较于glyLDL+V组,glyLDL+VP组细胞增殖率明显升高(p<0.05)；与NC组相比,siPHB组细胞增殖率明显下降,siPHB+GSPB2组增殖率有所回升(p<0.05)。7.PHB过表达质粒和siPHB对HUVEC细胞凋亡的影响GlyLDL+V组TUNEL阳性细胞率明显增高(p<0.05), glyLDL+VP组凋亡细胞率有所下降(p<0.05)；NC组与CC组细胞凋亡率无差别,siPHB组细胞凋亡率显著提高(p<0.05), siPHB+GSPB2组凋亡率有所下降(p<0.05)。8.PHB过表达质粒和siPHB对HUVEC细胞线粒体超微结构的影响CC组细胞线粒体具有板层状嵴,glyLDL+V组部分线粒体的板层状嵴结构消失,线粒体中出现囊泡状或高密度状结构,而glyLDL+VP组的线粒体异常得到明显缓解；NC组与CC组细胞线粒体结构无明显差别,siPHB组线粒体明显异常,siPHB+GSPB2组线粒体异常有所改善。9.PHB、糖基化LDL和GSPB2对HUVEC细胞Bax/Bcl-2比值、p-Akt的影响GlyLDL组与CC组相比, Bax/Bcl-2比值、p-Akt表达量明显升高(p<0.05),glyLDL+GSPB2组两者有所降低(p<0.05); glyLDL+V组Bax/Bcl-2比值、p-Akt表达量显著提高(p<0.05),而glyLDL+VP组两者有所下降(p<0.05)；siPHB组比NC组Bax/Bcl-2比值、p-Akt表达量明显增高(p<0.05),而siPHB+GSPB2组两者均降低(p<0.05)。结论1.糖基化LDL诱导人脐静脉内皮细胞凋亡,GSPB2对其有保护作用。2.糖基化LDL可能通过下调PHB蛋白表达量诱导人脐静脉内皮细胞凋亡,GSPB2可能通过抑制PHB蛋白表达量下调发挥其保护作用。第二部分葡萄籽原花青素B2对db/db小鼠胰腺的保护机制研究研究背景2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)是一种以高血糖和胰岛素抵抗为特征的慢些代谢性疾病。T2DM的传统治疗方式主要集中在控制血糖上,包括非药物治疗和药物治疗。非药物治疗主要是饮食控制、运动锻炼等方面的治疗,药物治疗主要包括口服降糖药和胰岛素治疗等。由于口服降糖药效果差、毒副作用明显,胰岛素治疗效果参差不齐等特点,有一大部分患者血糖控制差强人意。长期慢性的血糖升高逐步引发代谢紊乱、感染、血管病变等急、慢性并发症,严重影响着糖尿病患者的生活质量和生存周期。因此,对T2DM的致病机制和有效药物的研究迫在眉睫。胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是T2DM发病机制中的两个要素,虽然这两个因素对不同患者所具有的重要性不同,胰岛功能异常却是贯穿至中的因素。胰岛功能异常导致胰岛素分泌不足,无法对抗胰岛素抵抗,直接影响着糖尿病患者的疾病进程和预后。多种因素导致胰岛功能异常和胰岛素抵抗。近年来,炎性作用在糖尿病胰腺病变中的作用吸引了越来越多的注意。研究发现,在胰岛损伤和胰岛素抵抗的发展过程中,糖尿病患者体内促炎症因子不论在全身水平还是胰腺器官局部水平都有不同程度的提高,早期的T2DM的发病机制也与炎性作用有关,抑制炎症在某种程度上对糖尿病的治疗发挥一定的作用。保护胰腺本身的功能使其保持对机体血糖变化的感知、及时调控胰岛素分泌和释放,是一种非常有效而且安全的糖尿病治疗措施。GSPE是从葡萄籽中提取的一类黄酮类化合物,具有抗氧化应激、抗炎症、抗肿瘤及细胞保护等多种生物活性。动物实验发现,GSPE能有效改变胰腺microRNAs (miRNAs)的表达,也能调节胰腺中与胰岛素合成和分泌有关的蛋白的表达。但是对于其二聚体GSPB2对糖尿病胰腺的作用却鲜有报道。本实验将利用T2DM模型鼠db/db小鼠为研究对象,探索GSPB2对糖尿病胰腺的保护作用及其作用机制。研究目的1.研究GSPB2对db/db小鼠胰腺的保护作用。2.研究GSPB2对db/db小鼠胰腺保护作用的分子机制。研究方法T2DM模型鼠db/db小鼠为研究对象。16只雄性C57BLKS/J db/db小鼠及8只雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠,均为7周龄大小,适应性饲养一周后开始正式实验。首先测定所有小鼠空腹体重,按照空腹体重数值将16只C57BLKS/J db/db小鼠编号,随机选取8只作为糖尿病组(DM,n=8),其余8只作为GSPB2治疗组(DMT, n= 8);8只C57BLKS/J db/m小鼠全部作为正常对照组(CC,n=8)。实验期间给予DMT组小鼠每日GSPB2 30mg/kg灌胃,给予DM组同等剂量的生理盐水灌胃。连续灌胃10周,每周一次定期测量小鼠体重和进食量。实验结束后,将小鼠禁食12小时然后麻醉处死,采集各组小鼠血液测定空腹血糖(FBG)、AGEs、胰岛素等指标；取胰腺组织行HE染色观察胰腺形态学改变；留取部分胰腺组织用于Western Blot,测定乳凝集素(milk fat globule epidermal growth factor-8, MFG-E8)以及炎性因子白介素-1β(interleukin, IL-1β)和NLRP3的表达。研究结果1.GSPB2对db/db小鼠体重和进食量的影响相比较于CC组小鼠,DM组小鼠在实验过程中表现出显著的肥胖,体重明显升高(p<0.05)；加用GSPB2治疗的DMT组小鼠,从第12周开始,其体重较DM组有明显的下降(p<0.05),但仍显著高于CC组小鼠(p<0.05)。DM组小鼠的进食量在整个实验过程中高于CC组小鼠(p<0.05)；加用GSPB2治疗后,其进食量增长速度减慢,第12～18周,DMT组小鼠进食量较DM组明显减少(p<0.05)。2. GSPB2对db/db小鼠FBG和AGEs的影响DM组db/db小鼠的空腹血糖水平较CC组小鼠显著升高(p<0.05)；经GSPB2 mg/kg/day灌胃10周后,DMT组小鼠FBG水平并无显著下降。DM组小鼠的血浆AGEs水平较CC组明显升高(p<0.05)；而经GSPB2治疗的DMT组小鼠,其血浆AGEs水平有所降低(p<0.05)。3. GSPB2对db/db小鼠胰腺形态的影响糖尿病病变早期,胰岛素抵抗状态能反射性引起胰岛素水平增高和胰岛细胞团代偿性增大,持续的胰岛素升高和胰岛增大能导致胰岛β细胞耗竭,形成加重糖尿病的恶性循环。HE染色显示：DM组小鼠胰腺形态表现为胰岛膨大,胰岛面积较CC组大大增加(p<0.05)；而DMT组小鼠的胰岛面积较DM组有所减小(p<0.05),但仍大于正常对照组小鼠(p<0.05)。4. GSPB2对db/db小鼠胰岛素水平和HOMA-IR的影响DM组小鼠的血浆胰岛素水平较CC组显著升高(p<0.05), DMT组小鼠的血浆胰岛素水平有所下降(p<0,05)。通过计算HOMA-IR发现：DM组小鼠的HOMA-IR水平较CC组明显升高(p<0.05),而DMT组小鼠的HOMA-IR水平有所回升(p<0.05)。5. GSPB2对db/db小鼠胰腺MFG-E8表达水平的影响Western Blot实验结果显示：MFG-E8正常表达于CC组小鼠的胰腺中,与之相比,DM组小鼠胰腺中MFG-E8的表达显著提高(p<0.05),而DMT组小鼠胰腺的MFG-E8表达量有所降低(p<0.05)。6. GSPB2对db/db小鼠胰腺IL-1β、NLRP3表达水平的影响Western Blot实验结果显示：与CC组小鼠相比,DM组小鼠胰腺中IL-1β、 NLRP3的蛋白表达量明显增高(p<0.05),而DMT组小鼠胰腺中IL-1β、NLRP3的蛋白表达量有所下降(p<0.05)。结论1.GSPB2通过抗炎症作用对糖尿病胰腺发挥保护作用。2. GSPB2对糖尿病胰腺的抗炎症作用可能与调节MFG-E8、IL-1β和NLRP3的蛋白表达有关。