论文部分内容阅读
研究背景:近年来,表观遗传学(epigenetics)已成为生命科学中普遍关注的前沿学科。表观遗传学是与遗传学(genetics)相对应的概念。在人类基因组中含有两类信息:一类是传统意义上的遗传学信息,它提供了合成生命所必需的所有蛋白质的模板;另一类是表观遗传学信息,它提供了何时、何地及如何应用遗传学信息的指令,以确保基因适当地开关。遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化,如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等;而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化。表观遗传学研究主要涉及DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰、染色质重塑以及MicroRNA、SiRNA等。大量研究表明表观遗传学异常与人类多种疾病密切相关,尤其在肿瘤的发生发展过程中,表观遗传学改变更是起重要作用。多聚腺苷二磷酸核糖基聚合酶-1(poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)是较早认识到的DNA损伤感应及监测分子,是最早发现的PARP超家族成员,也是至今研究得最多的一个。它广泛存在于真核细胞中,是一类重要的蛋白质翻译后修饰酶,负责细胞内90%的聚ADP-核糖基聚合体合成。从PARP-1发现至今的短短四十余年中,该酶一直是分子生物学领域关注的热点之一。随着研究的不断深入,已经证明,PARP参与许多重要的生命活动如凋亡、转录、DNA修复、细胞死亡、染色体功能、基因组完整性和DNA甲基化等,PARP-1抑制剂在糖尿病、急慢性炎症、出血性休克及心脏、肾、肠的缺血再灌注损伤等的治疗中也发挥重要作用。
目的:应用RNA干扰技术建立人支气管上皮细胞16HBE的PARP-1基因缺陷细胞株,动态观察BaP诱发人支气管上皮细胞恶性转化过程中的表观遗传改变,并探讨PARP-1在表观遗传改变中的作用,为阐明PARP-1参与BaP引起表观遗传改变的分子机制和寻找BaP致癌过程中早期敏感的生物标志物提供理论依据,为化学致癌的防治提供新的思路。
方法:
⑴应用慢病毒介导的RNA干扰技术构建人支气管上皮细胞(16HBE)的PARP-1缺陷细胞株(16HBE-shPARP1),作为本研究的工具细胞;同时比较两种细胞的一般生物学特性(包括生长状况、细胞形态学和细胞周期等)。
⑵分别以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L的BaP处理16HBE和16HBE-shPARP1细胞12h和24h,用单细胞凝胶电泳实验检测两种细胞的DNA损伤程度;再将BaP处理24h后的两组细胞分别恢复培养12h和24h,用单细胞凝胶电泳实验检测其损伤DNA恢复情况。
⑶分别以1.0、2.0、5.0、10.0、15.0和30.0μmol/L BaP处理16HBE和16HBE-shPARP1细胞72h,以5-甲基胞嘧啶细胞免疫荧光和高效毛细管电泳法检测各处理组细胞基因组DNA整体甲基化水平;同时以基于ELISA样反应和生物素标记底物NAD+法检测胞内总体甲基转移酶和PARP酶活性,并以RT-Q-PCR和Western Blotting检测PARP-1和甲基化相关酶的mRNA和蛋白表达水平。
⑷以40.0μmol/L BaP诱导处理16HBE细胞24h,随后换正常培养基培养、传代,每周诱导处理一次;每隔三周取细胞做软琼脂克隆形成实验和裸鼠皮下成瘤实验,鉴定细胞的恶性程度,最终以BaP诱导18周后恶性转化的16HBE细胞为诱导终点,简称为BTC。
⑸以RT-Q-PCR和Western Blotting分别检测BaP诱导16HBE细胞恶性转化各阶段细胞PARP-1和肿瘤相关基因p53及k-ras的mRNA和蛋白表达水平;在亚硫酸氢盐修饰基因组DNA的基础上,以MSP检测上述各基因启动子区特异位点的甲基化状况;同时对各阶段细胞的PARP-1和p53启动子区的CpG岛进行克隆测序,全面观察目的基因启动子区甲基化修饰状况。
⑹以细胞免疫荧光法检测各阶段细胞组蛋白H3、H4整体乙酰化水平;同时以基于ELISA样反应检测胞内总体组蛋白去乙酰化酶的活性,并RT-Q-PCR和Western Blotting检测组蛋白去乙酰化酶的mRNA和蛋白表达水平。
结果:
①16HBE和16HBE-shPARP1细胞经BaP染毒处理后,其DNA损伤的程度均呈剂量、时间依赖性加剧;对两种细胞进行平行比较发现,染毒剂量和染毒时间一定时,16HBE-shPARP1细胞的各损伤指标均明显高于16HBE细胞,PARP-1基因的沉默可加重BaP引起的16HBE细胞DNA损伤程度。
②利用5mdC抗体进行细胞免疫荧光实验,从形态学上观察细胞基因组DNA甲基化的定位并比较各处理组之间平均荧光强度的变化趋势。结果显示,与16HBE细胞相比,16HBE-shPARP1细胞的平均荧光强度明显增高。两种细胞经BaP染毒处理72h后,随着染毒剂量的增加,各处理组细胞的平均荧光强度值均呈略增高后逐渐降低的趋势;当染毒剂量为30.0μmol/L时,16HBE和16HBE-shPARP1细胞的平均荧光强度值显著降低。
③16HBE及16HBE-shPARP1细胞经BaP处理72h后,随着BaP染毒剂量的增加,两种细胞胞内PARP酶活性及PARP-1的mRNA、蛋白表达水平均呈现先增高后降低的一致趋势,16HBE-shPARP1细胞各处理组普遍显著低于16HBE细胞组。于最高染毒剂量组30.0μmol/L时,两种细胞的PARP-1表达水平下降显著。
④5mdC甲基化免疫荧光实验结果显示,在BaP诱导16HBE细胞恶性转化过程中,与正常16HBE细胞相比,随着BaP诱导时间的延长,各阶段细胞基因组DNA整体甲基化水平逐渐降低。用HPCE进一步进行定量检测发现,正常16HBE细胞中平均mCpG%值约为4.78%,随着BaP诱导时间的延长,六个阶段细胞的mCpG%值分别为4.62±0.39%、3.82±0.39%、4.07±0.40%、3.27±0.31%、2.63±0.21%和2.48±0.15%;BTC细胞经DAC处理72h后,其mCpG%值进一步下降为2.11±0.09%。
⑤16HBE细胞经BaP诱导恶性转化过程中,随着BaP诱导处理时间的延长,16HBE细胞中PARP-1的mRNA和蛋白表达水平均逐渐增高,并在BTC细胞中表达水平达到最高。对癌基因k-ras和抑癌基因p53进行表达检测发现,随着16HBE细胞恶性程度的增加,k-ras表达逐渐增高,其中,BTC细胞中k-ras基因的表达量为正常对照组16HBE细胞的8倍以上;而p53的表达水平则呈逐渐降低的趋势,并于BTC细胞中降低最显著。
⑥细胞免疫荧光实验显示,随着BaP诱导时间的延长,与正常对照组16HBE细胞相比,诱导各阶段细胞的组蛋白H3、H4整体乙酰化水平均呈逐渐降低的趋势,而组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA处理可抑制BTC细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平的降低趋势。利用ELISA样反应对胞内总体组蛋白去乙酰化酶的活性进行检测发现,随着诱导时间的延长,各阶段细胞中总体组蛋白去乙酰化酶活性呈逐渐升高的趋势;具体来看,与正常对照组16HBE细胞相比,六阶段细胞中HDACs活性分别增高了18.3%、35.0%、49.6%、53.3%、54.8%和83.6%。采用RT-Q-PCR和Western Blotting对HDACs表达水平进行检测发现,随着BaP诱导处理时间的延长,HDAC-1和HDAC-2的mRNA和蛋白表达水平均逐渐增高,并于BTC细胞中增高显著;TSA处理均能降低BTC细胞中HDAC-1和HDAC-2的表达水平。HDAC-3在各阶段细胞中的表达水平变化并不明显。
结论:
⑴利用慢病毒介导的RNAi技术成功构建人支气管上皮细胞的PARP-1基因缺陷细胞株,沉默效果显著且稳定性好,为后续PARP-1基因功能研究提供了有效的工具细胞。
⑵PARP-1缺陷可增加16HBE细胞对BaP的敏感性,PARP-1对BaP引起16HBE细胞DNA损伤的早期修复至关重要。
⑶PARP-1对胞内DNMT-1的活性具有抑制效应,且这种效应随着PARP-1的缺失而缓解;PARP-1所催化的ADP核糖基化反应可通过抑制DNMT-1的酶活性来调节BaP诱导的16HBE细胞DNA甲基化水平改变。
⑷BaP诱发16HBE细胞恶性转化过程中,基因组DNA整体甲基化水平逐渐降低,使得基因组的不稳定性增强,这是引发多种遗传学和表观遗传学改变的积累,是最终导致细胞恶性转化的早期驱动力。
⑸BaP诱发16HBE细胞恶性转化过程中,PARP-1和癌基因k-ras表达显著上调,抑癌基因p53表达下调,这些改变均不受基因启动子区甲基化水平的调控,启动子区组蛋白修饰是上述基因转录调控的主要表观遗传方式。