研究背景和意义：细菌性脑膜炎(Bacterial Meningitis, BM),又称化脓性脑膜炎,是一种严重的中枢神经系统(Central Nervous System, CNS)感染性疾病,软脑膜及蛛网膜因细菌感染而发生化脓性改变,并使脑脊液(Cerebrospinal Fluild, CSF)产生炎症性变化,致死率及致残率较高,在婴幼儿中尤为常见。有报道显示,在我国每十万儿童中就有69.8人患有BM,在新生儿中,BM发生率约占活产儿的0.2‰～‰,早产儿可高达3‰,其中日龄<7天的BM患儿占61.7%,日龄<2天的BM患儿占29.8%。自从1805年对BM开始认识到20世纪初期,其一直是一种能够极易危害儿童以及成人健康的严重的感染性疾病,尽管20世纪30年代后抗菌药物在临床的应用使得许多病例获得治愈,其病死率已由50-90%降至20%以下,但50%以上的BM患者由于神经元的损伤而罹患远期神经功能缺损后遗症,如智力障碍、听力缺失、癫痫、学习和记忆能力丧失等。目前,对BM的治疗面临着菌种变迁、细菌耐药性增强等严峻问题,因此寻找有效的治疗手段,通过早期治疗减少BM患者后遗症的产生,对提高BM患者的治愈率,改善其生活质量具有非常重要的意义。近年来,BM患者CSF中的氧化还原平衡状态在BM病理机制的研究中越来越多的受到人们的关注。氧化应激(Oxidative Stress, OS)是机体中常见的氧化损伤,与炎症、肿瘤等一些病理过程关系密切,当机体中的自由基(Free Radical, FR)过多,超过机体抗氧化系统的清除能力时便会发生OS。研究表明,体内氧化还原状态失衡是BM引起脑损伤的重要原因之一。在新生儿脑组织中,儿茶酚胺和不饱和脂肪酸等易氧化物质的含量较成人高,而谷胱苷肽过氧化物酶、血清转铁蛋白、铜蓝蛋白、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)等内源性抗氧化剂含量较低,使其成为氧化损伤的易感人群。在BM的病理过程中,大量的炎症因子及促炎因子如TNF-α、IL-1β和IL-6等的释放及基质金属蛋白酶(Matrix Metalloproteinase, MMP)的激活促进了脑损伤的产生。小胶质细胞具有对细菌的识别和移除作用,其过度激活将产生神经毒性,诱导机体产生OS,从而加重BM患者的神经损伤。已经证实抗氧化剂可以通过抑制P38丝裂原激活蛋白激酶的激活而产生抗炎作用。因此,寻找适当的抗氧化剂,并进一步研究其在BM治疗过程中的作用机制,对靶向治疗BM具有重大的意义。依达拉奉(Edaravone, EDA),是一种新型的强效抗氧化剂,具有很强的抗氧化活性,能够有效地清除氧自由基。已有大量的研究表明,EDA可以通过抑制机体内一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase, NOS)的活性,缓解神经细胞和血管内皮细胞的氧化损伤,从而对神经系统产生保护作用。目前,EDA在临床上作为一种神经保护剂,已被成功应用于急性脑梗死引起的神经系统损伤。Nakamura T等人发现,用EDA对患有急性脑出血(Acute Intracerebral Hemorrhage, ICH)的大鼠进行治疗,在给大鼠注射EDA时或注射2h后,大鼠脑水肿及神经功能缺损的症状得到明显改善。此外,Yun Y等人的研究发现,在小胶质细胞活化过程中,EDA发挥了高效的抗炎症作用。海马组织凋亡和皮质坏死是BM患者脑组织中最常见的病理改变。研究表明,BM患者学习和记忆能力的丧失与大脑海马区神经元的凋亡有着密切的关系。目前,虽然已有研究将EDA应用于BM的治疗,但其在BM造成海马区损伤的保护作用及机制尚未见报道,这为我们进一步研究EDA在BM中发挥的作用提供了新的突破口。研究目的：1.构建肺炎链球菌BM小鼠模型,研究EDA对BM产生的临床症状的影响2.研究EDA对BM的炎症治疗作用,及对BM引发的海马损伤的保护作用。3.研究EDA在保护BM引发的海马损伤中的作用机制。研究材料及方法：1. 主要材料依达拉奉注射剂(5ml/10mg,日本Mitsubishi Pharma公司),肺炎链球菌(Streptococcus Pneumoniae, SP) III型(ATCC6303,美国Tissue Cell Culture),巴比妥钠(1.0%,美国Sigma公司),尼氏染色液(碧云天生物技术研究所),Tunel试剂盒(德国默克公司),牛鲍氏计数板(法国Poly Labo Paul Block & Cie公司),TNFa试剂盒、IL-6试剂盒和IL-8试剂盒(美国R&D公司),C57BL/6小鼠(军事医学科学院实验动物中心),Nrf2基因敲除C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory),HO-1基因敲除C57BL/6小鼠(Jackson Laboratory)。2. 主要方法2.1 EDA对BM新生小鼠临床症状的影响对健康C57BL/6小鼠注射制备好的肺炎链球菌Ⅲ型菌悬液(1.0×104cfu/mL)以构建BM小鼠模型。健康小鼠随机编号,分成四组：生理盐水组(经侧脑室注射生理盐水)、EDA组(经侧脑室注射EDA)、BM组(经侧脑室注射肺炎链球菌+生理盐水)及EDA干预组(经侧脑室注射肺炎链球菌+EDA),每一组小鼠又随机分成24h,48h和72h三个亚组。采用小鼠脑脊液白细胞计数法鉴定BM模型是否构建成功,根据小鼠Loeffler神经行为学评分、体重变化及存活率分析评价EDA对BM小鼠的影响。2.2 EDA对BM新生小鼠海马区组织病理学的影响基于第一部分BM小鼠模型的建立与分组,首先对不同组别中小鼠脑组织标本进行取材和保存备用。采用干湿重差值法对各组小鼠脑含水量进行测定和比较,对各组小鼠的海马组织进行Nissl染色,以评价海马区神经元的损伤情况,对各组小鼠的海马组织进行原位末端转移酶标记染色(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase -mediated Dutp Nick-End Labeling, TUNEL),以评价海马区神经元的凋亡情况。2.3 EDA对BM新生小鼠海马组织中脑损伤标志物的影响及机制探究以第一部分BM小鼠模型的构建和分组为基础,引入EDA干预核因子NF-E2相关因子(Nuclear Factor Erythroid 2 Related Factor, Nrf2)基因敲除组(Nrf2基因敲除小鼠,经侧脑室注射肺炎链球菌+EDA)及EDA干预血红素氧合酶1(Heme Oxygenase-1, HO-1)基因敲除组(HO-1基因敲除小鼠,经侧脑室注射肺炎链球菌+EDA)。首先,采用酶联免疫吸附测定法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)研究各组小鼠海马组织中炎症因子肿瘤坏死因子-a(Tumor Necmsis Factor-a, TNF-a)及促炎因子白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)和白介素-8 (Interleukin-8, IL-8)的浓度变化,应用定量反转录聚合酶链反应(Quantificational Real-time Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)>蛋白印迹(Western blot)以及免疫组化分析技术研究不同组别小鼠海马组织中脑损伤标记物高迁移率族蛋白B1(High Mobility Group Box 1, HMGB1)和诱导型NOS(Induced NOS, iNOS)的变化。2.4统计学分析使用SPSS21.0软件分析,计量指标结果用均数±标准差(X±SD),数据作正态性W检验和方差齐性Levene检验；组间比较采用完全随机设计单因素方差分析及析因设计的方差分析,多组比较采用LSD或DunnettT3;计数资料采用两独立样本卡方检验。统计分析均以P<0.05为具有统计学意义。结果：1. EDA对BM新生小鼠临床症状的影响经蓝墨水注射法证明肺炎链球菌接种定位准确。在BM建模后24h时,测得BM组小鼠脑脊液中的白细胞计数为(12.58±2.93)／μL,比生理盐水对照组(0.67±1.08)／μL显著升高(P<0.001),同时测得EDA干预组小鼠脑脊液中的白细胞计数为(4.75±2.07)／μL,比BM组显著降低(P<0.001)。通过对小鼠生理状况的观察发现,在处理24h、48h和72h后,生理盐水组和EDA组小鼠精神状态与活动能力良好,而BM组小鼠出现精神萎靡、反应迟钝、厌食、自主活动减少,EDA干预组小鼠的精神状况和进食得到了一定程度的改善。在24h、48h和72h三个时间点,生理盐水组和EDA组小鼠的Loeffler评分均为5.00±0.00；BM组的Loeffler评分在三个时间点分别为3.44±0.31,2.19±0.36,1.75±0.26,且随时间的增加Loeffler评分逐渐降低(P<0.001),而EDA干预组小鼠的Loeffler评分在三个时间分别为4.13±0.43,4.25±0.37,4.31±0.36,与BM组相比升高显著(P<0.001),且随时间的增加Loeffler评分无明显变化(P>0.05)。生理盐水组和EDA组小鼠在24h、48h和72h三个时间点的体重变化均无显著差异(P>0.05)；EDA干预组小鼠在三个时间点的体重增加值分别为(-0.23±0.11)g, (-0.27±0.20)g和(-0.28±0.18)g,与BM组小鼠在三个时间点的体重增加值(-0.81±0.11)g, (-1.49±0.17)g和(-2.55±0.31)g相比,EDA干预组体重的减少量显著降低(P<0.001)。BM组小鼠的存活率为25%,而EDA干预组的小鼠存活率为75%,与BM组相比,EDA干预组显著升高,且差异具有统计学意义(P<0.001)。2. EDA对BM新生小鼠海马区组织病理学的影响对各组小鼠的脑组织进行大体观察发现,生理盐水组和EDA组小鼠的脑组织外观正常,BM组在感染24h后出现明显的水肿并伴有脑膜粘连,而EDA干预组只是偶有水肿和充血表现,未出现脑膜粘连。在24h、48h和72h三个时间点BM组小鼠的脑含水量分别为(84.17±0.14)%,(91.34±0.12)%,(98.56±0.32)%,与生理盐水对照组的脑含水量(77.46±0.36)%,(77.58±0.27)%,(77.63±0.07)%相比显著增加(P<0.001),而在相应的时间点时EDA干预组的脑含水量分别为(81.21±0.23)%,(81.15±0.11)%,(80.96-0.59)%,与BM组相比显著降低(P<0.001)。Nissl染色结果显示,BM组海马组织中的尼氏染色阳性细胞数在24h、48h和72h三个时间点分别为92.25±2.38,82.25±0.71和80.00±0.76,EDA干预组的尼氏染色阳性细胞数与之相比显著升高(P<0.001),在三个时间点分别为104.25±2.25,104.63±1.06和103.88±1.73。在Tunel染色中,BM组海马组织中的Tunel染色阳性细胞数在24h、48h和72h三个时间点分别为17.38±3.16,26.13±3.18和38.13±2.03,显著高于EDA干预组中的12.25±2.55,11.75±3.49和12.00±3.25(P<0.05)。3.EDA对BM新生小鼠海马组织中脑损伤标志物的影响及机制探究通过ELISA检测发现,在EDA干预组小鼠的海马组织上清液中,TNF-α在各个时间点的浓度分别为(224.88±1.96 ) pg/mL, (225.13±3.09) pg/mL, (223.88±3.40) pg/mL,显著低于BM组的(715.25±2.38) pg/mL, (782.13±2.95) pg/mL, (821.13±3.68)pg/mL (P<0.001) ; IL-6在EDA干预组各个时间点的浓度分别为(105.88±2.23)μg/g, (105.50±3.12) μg/g, (105.00±1.93) μg/g,显著低于BM组的(152.13±1.73) μg/g, (161.13±1.55) μg/g, (173.13±2.59) μg/g (P<0.001);IL-8在 EDA干预组各个时间点的浓度依次为(55.25±2.82) μg/g, (54.88±2.53) μtg/g, (54.13±2.59)μg/g,显著低于BM组的(72.50±3.66)μg/g, (82.38±3.34) μg/g, (92.13±2.75) μg/g (P<0.001)。随着时间的增加,EDA干预组小鼠海马组织上清液中TNF-α、IL-6和IL-8的浓度均无显著变化(P>0.05)。通过对各组小鼠处理24h后HMGB1 mRNA表达情况的研究发现,HMGB1在BM组小鼠的海马组织中高表达(1.73±0.30),当对BM小鼠进行EDA干预后HMGB1在小鼠海马组织中的mRNA表达显著降低(0.91±0.18)(P<0.001)；而用EDA干预Nrf2基因敲除BM小鼠和HO-1基因敲除BM小鼠后,两组小鼠海马组织中HMGB1的mRNA表达(1.67±0.17,1.71±0.33)与BM组小鼠相比无显著差异(P>0.05),与EDA干预组小鼠相比差异有显著性(P<0.05)。蛋白印迹结果表明,HMGB1在蛋白水平的表达情况与基因水平的表达情况相一致,即处理24h后,HMGB1在BM组小鼠的海马组织中高表达(1.55±0.31),EDA干预组小鼠海马组织中的HMGB1的表达(0.54±0.23)与BM组小鼠相比显著降低(P<0.001),而EDA干预Nrf2基因敲除组小鼠和EDA干预HO-1基因敲除组小鼠海马组织中HMGB1的蛋白表达(1.57±0.35,1.51±0.38)与BM组小鼠相比无显著差异(P>0.05),与EDA干预组小鼠相比差异有显著性(P<0.001)。免疫组化的结果进一步研究了HMGB1在各组小鼠中的表达情况,BM组小鼠海马组织中HMGB1阳性细胞数在处理24h、48h和72h后依次为40.63±1.85,54.88±1.36和68.13±1.46,与对照组(1.25±0.89,2.00±1.07,1.88±1.13)相比显著增加(P<0.001), EDA干预组小鼠海马组织中HMGB1阳性细胞数在三个时间点依次为30.13±1.55,29.88±1.46和30.13±1.46,与BM组小鼠相比显著降低(P<0.001),而EDA干预Nrf2基因敲除组小鼠的40.25±2.25,54.88±1.46,68.00±2.00和EDA干预HO-1基因敲除组小鼠的41.00±1.69,55.25±1.58,67.88±1.55与BM组小鼠相比无显著差异(P>0.05),与EDA干预组小鼠相比差异有显著性(P<0.001)。蛋白印迹结果表明,在各组小鼠处理24h后,iNOS在BM组小鼠的海马组织中高表达(1.55±0.23),EDA干预组小鼠海马组织中的iNOS的表达(0.56±0.14)与BM组小鼠相比显著降低(P<0.001),而EDA干预Nrf2基因敲除组小鼠和EDA干预HO-1基因敲除组小鼠海马组织中iNOS的蛋白表达(1.57±0.25,1.51±0.16)与BM组小鼠相比无显著差异(P>0.05),与EDA干预组小鼠相比差异有显著性(P<0.001)。免疫组化的结果进一步研究了iNOS在各组小鼠中的表达情况,BM组小鼠海马组织中iNOS阳性细胞数在处理24h、48h和72h后依次为35.38±1.69,56.38±1.41和81.63±1.19,与对照组(0.25±0.46,0.25±0.46,0.13±0.35)相比显著增加(P<0.001),在经过EDA干预后,BM小鼠海马组织中iNOS阳性细胞数在三个时间点依次为29.38±1.41,29.75±1.39和31.00±1.07,与BM组小鼠相比显著降低(P<0.001),而EDA干预Nrf2基因敲除组小鼠的33.88±2.03,54.38±1.41,82.63±1.19和EDA干预HO-1基因敲除组小鼠的34.88±1.73,55.75±1.83,81.75±1.04与BM组小鼠相比无显著差异(P>0.05),与EDA干预组小鼠相比差异有显著性(P<0.001)。结论：1.EDA对BM新生小鼠的行为特性、体重以及存活率有一定的改善,且能够有效抑制BM小鼠脑脊液中的中性粒细胞的浸润。2.通过EDA治疗,BM新生小鼠脑水肿情况得到显著改善。同时,EDA能够减少BM新生小鼠海马组织中神经元的细胞凋亡,增强BM新生小鼠海马组织中神经细胞功能活性。对于该药用于防治BM的最佳用量有待进一步研究。3.EDA降低了BM新生小鼠海马区TNF-α及IL-8和IL-6的浓度,抑制HMGB1在该区域的mRNA和蛋白水平的表达,抑制iNOS在该区域的蛋白水平的表达,通过Nrf2/HO-1途径发挥BM诱导的海马损伤的保护作用。但EDA在BM诱导的海马组织损伤中的保护作用的更详细机制有待进一步研究。