研究背景和目的膜联蛋白A7（Annexin A7,ANXA7）是膜联蛋白家族成员之一,它是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白,具有GTPase活性。ANXA7基因定位于人10q21染色体上,该位点含有多个潜在的肿瘤抑制基因。ANXA7（-/-）纯合子基因敲除小鼠胚胎期10天致死,ANXA7（+/-）杂合子基因敲除小鼠自发性肿瘤的发生率增加,约为20-50%,自发性肿瘤在多个器官均有发生,包括肝脏、前列腺、子宫内膜、唾液腺和胸腺等。在形成自发瘤的小鼠中,42%的小鼠肿瘤发生了转移。说明ANXA7在抑制肿瘤的发生和转移中发挥重要作用。凋亡是抵抗肿瘤最有效的方法之一,研究发现,ANXA7能够促进前列腺癌、神经胶质瘤和乳腺癌细胞发生凋亡。在前期工作中,我们鉴定了 ANXA7 GTPase的抑制剂—ABO,能够抑制apoE-/-小鼠内皮层的凋亡,从而抑制动脉粥样硬化的发展。鉴于ANXA7在抑制肿瘤发生发展中的重要作用,我们提出ANXA7 GTPase的激活可能促进肿瘤细胞凋亡的假设。但是目前,ANXA7 GTPase对肿瘤细胞凋亡的调控作用仍不明确。在本研究中,我们拟鉴定ANXA7 GTPase的化学小分子激活剂,以ANXA7 GTPase的激活剂和抑制剂为工具,研究ANXA7 GTPase调控肿瘤细胞凋亡的机制。我们前期的研究表明,ANXA7与膜整联蛋白β4（integrin β4,ITGB4）间存在相互作用,ANXA7 GTPase可以调节其相互作用蛋白的磷酸化,ABO抑制ANXA7 GTPase活性,降低ITGB4 Y1494位点的磷酸化。ITGB4是一种肿瘤相关抗原,在多种肿瘤细胞中高表达。ITGB4的功能与其细胞定位密切相关。定位于细胞质膜上的ITGB4促进肿瘤的生长和转移;定位于细胞核中的ITGB4能够诱导血管内皮细胞凋亡。但是ITGB4入核对肿瘤细胞凋亡的作用及其入核的分子机制均未明确。ITGB4作为信号转导分子的功能受其胞内域磷酸化的调控。其中Y1494作为ITGB4磷酸化的核心控制位点,该位点的突变会抑制ITGB4胞内域其他酪氨酸位点的磷酸化。此外,ANXA7能够通过发挥GTPase活性介导脂膜融合,膜融合过程在细胞膜受体以膜泡运输方式入核中发挥重要作用。结合我们之前的研究结果,我们推测ANXA7 GTPase的活化可能通过增加ITGB4的磷酸化,诱导ITGB4入核,促进肿瘤细胞凋亡。在本研究中,我们拟验证该假设。研究表明ANXA7能够抑制前列腺癌、胶质瘤和胰腺癌的转移。但是ANXA7 GTPase对肿瘤转移的作用及其调控机制仍不清楚。Raf激酶抑制蛋白（Raf kinase inhibitory protein,RKIP）是一种肿瘤转移抑制因子,在多种肿瘤中表达水平下降。RKIP转移抑制作用首先是在前列腺癌中鉴定出来的。ANXA7作为一种GTPase,能够与GTP结合。已有研究表明,RKIP能够与GTP结合蛋白相互作用。RKIP与靶蛋白的结合会抑制激活因子对靶蛋白的活化,而导致相关信号通路的改变,调控肿瘤转移。那么RKIP是否可以与ANXA7结合从而抑制激活剂对ANXA7 GTPase的激活呢?此外,有研究发现,壬基苯酚能够诱导睾丸支持细胞中RKIP表达水平增加,同时ANXA7蛋白水平下降。但是,目前RKIP对ANXA7介导的信号通路的调控作用尚未明确。在本研究中,我们选取了转移性的前列腺癌细胞系PC3,并构建了 RKIP敲除的HEK293T细胞系（HEK293T RKIP-/-）,与RKIP野生型的HEK293T细胞系（HEK293T RKIP+/+）共同作为细胞模型,研究ANXA7 GTPase对肿瘤转移的调控机制。综上所述,在本论文中,我们拟以ANXA7 GTPase的激活剂和抑制剂为工具,以ANXA7 GTPase对ITGB4入核的调控为切入点,研究ANXA7 GTPase介导ITGB4入核的机制和细胞核中ITGB4调节凋亡相关基因的表达机制,以明确ANXA7 GTPase促进肿瘤细胞凋亡的作用机理。我们以转移性的前列腺癌细胞系PC3及HEK293T RKIP+/+和RKIP-/-细胞为细胞模型,研究ANXA7 GTPase抑制前列腺癌转移的机制。为肿瘤治疗中有效靶标的发现和新药先导化合物的研发奠定理论和物质基础。研究内容1.ANXA7诱导ITGB4入核,促进肿瘤细胞凋亡的机制研究。1.1 ANXA7 GTPase激活剂的鉴定。1.2 ANXA7诱导ITGB4入核的调控机制。1.3细胞核中ITGB4对凋亡相关基因表达的调控。1.4鸡胚尿囊膜人移植瘤模型的体内验证。2.ANXA7激活AMPK,抑制肿瘤转移的机制研究。2.1 ANXA7抑制前列腺癌PC3细胞迁移的作用。2.2 ANXA7激活AMPK,抑制促转移基因表达的机制。2.3 RKIP与ANXA7的结合对ANXA7 GTPase活化所介导的信号通路的抑制作用。2.4裸鼠PC3-3M-Luc原位肿瘤转移模型的体内验证。研究方法1.本论文是以化学小分子SEC（ANXA7 GTPase激活剂）和ABO（ANXA7 GTPase抑制剂）为工具进行相关研究。2.ANXA7 GTPase活性检测:分离纯化ANXA7野生型、T275A和T286A突变型蛋白,SEC与ANXA7蛋白共孵育,利用GTPase活性检测试剂盒检测SEC对ANXA7 GTPase活性的影响。3.Western blot检测相关蛋白水平和蛋白磷酸化水平变化,qPCR和RT-PCR检测基因mRNA水平。4.SRB实验检测细胞存活率,Hoechst33258染色检测细胞凋亡率。5.ITGB4的核质分布检测:5.1利用免疫荧光技术检测ITGB4在细胞核和细胞质中的定位。5.2利用细胞核质分离试剂盒分别提取细胞核组分和细胞质组分,Western blot检测细胞核和细胞质组分中ITGB4的蛋白水平。6.利用染色质免疫沉淀技术（ChIP）检测细胞核中ITGB4与ATF3启动子的结合情况。7.蛋白间的相互作用检测:7.1利用免疫共沉淀技术检测蛋白间的结合情况。7.2利用免疫荧光技术检测蛋白间的共定位情况。8.相关蛋白在细胞信号通路中的功能研究:8.1利用RNA干扰技术或基因敲除技术抑制细胞中特定蛋白的表达。8.2利用过表达技术上调或恢复细胞中特定蛋白的表达。8.3利用定点突变技术构建ANXA7和ITGB4关键位点突变型过表达载体,mCherry-ANXA7-wt,mCherry-ANXA7-mtl（T275A）,-mt2（T286A）,-mt3（T286D）和 pEGFP-ITGB4-wt,pEGFP-ITGB4-mt（Y1494A）,以明确相应位点在ANXA7活性和功能调控及ITGB4入核调控中的作用。9.SEC促进肿瘤细胞凋亡的体内验证:9.1利用鸡胚尿囊膜建立人移植瘤模型,SEC处理7 d后检测肿瘤体积。9.2肿瘤组织冰冻切片后,TUNEL染色检测凋亡情况。10.SEC对血管生成作用的检测:10.1利用鸡胚尿囊膜模型,明胶海绵为化学小分子滴加载体,检测SEC对鸡胚尿囊膜正常血管生成的影响。10.2利用Matrigel血管生成实验检测SEC对血管内皮细胞血管生成的影响。11.细胞迁移能力检测:11.1利用划痕实验检测细胞的迁移能力。11.2 Western blot检测上皮标志物E-Cadherin和间质标志物Vimentin蛋白水平变化,衡量细胞的上皮间质转化（EMT）过程。12.SEC抑制肿瘤转移的体内验证:12.1建立裸鼠PC-3M-Luc原位转移肿瘤模型,SEC处理3周后,进行小鼠整体发光成像记录荧光光子数。12.2收取小鼠腹主动脉淋巴结,进行离体器官成像,记录荧光光子数,并统计发生转移的小鼠淋巴结数目。研究结果1.SEC 激活 ANXA7 GTPase 活性。1.1 SEC以时间和浓度依赖的方式升高ANXA7 GTPase活性,T275A突变不影响SEC对ANXA7 GTPase的激活作用,T286A突变后,SEC不能激活该ANXA7突变体的GTPase活性。1.2 SEC能够与ANXA7结合,T275A突变不影响SEC与ANXA7的结合,T286A突变后,SEC不能与该ANXA7突变体结合。2.SEC诱导ITGB4入核,促进ITGB4高表达的肿瘤细胞凋亡。2.1 SEC处理使ITGB4高表达的肿瘤细胞（前列腺癌细胞PC3,肺癌细胞A549,结肠癌细胞HCT116和乳腺癌细胞MCF-7）存活率降低,凋亡率增加;而对ITGB4低表达的肝细胞L-02及HEK293细胞生长没有影响,HEK293细胞中过表达ITGB4后,SEC使其存活率下降。2.2 SEC处理诱导肿瘤细胞中内源性ITGB4和HEK293细胞中外源过表达的ITGB4向细胞核转移。3.SEC促进ANXA7与ITGB4结合,ANXA7通过发挥GTPase活性,促进ITGB4入核。3.1 SEC以浓度依赖的方式促进ANXA7与ITGB4的结合,在干扰掉ANXA7的表达后,SEC不能诱导ITGB4向细胞核的转移。3.2用ANXA7 GTPase抑制剂ABO处理,显著抑制了 SEC诱导的ANXA7与ITGB4的结合,同时ITGB4的入核也受到了明显抑制。3.3 与转染 mCherry-ANXA7-wt 和-mtl（T275A）相比,在细胞中转染 mCherry-ANXA7-mt2（T286A）突变体后,SEC诱导的ITGB4的入核明显减弱。4.ANXA7 GTPase促进ITGB4 Y1494位点的磷酸化,启动ITGB4入核。4.1将ITGB4的Tyr1494突变为Ala后,SEC不能诱导该ITGB4突变体的核位移。4.2 SEC促进ITGB4 Y1494位点的磷酸化。干扰ANXA7的表达,用ANXA7 GTPase抑制剂ABO处理,及过表达mCherry-ANXA7-mt2（T286A）的突变体后,均抑制了 SEC诱导的1TGB4 Y1494位点磷酸化水平的上调。5.进入细胞核中的ITGB4诱导促凋亡基因的表达。5.1 SEC以时间依赖的方式诱导促凋亡基因ATF3,PPP1R15A,IL8和TRIB3的mRNA水平的升高,干扰掉ITGB4的表达后,SEC不能促进这些基因的表达。5.2细胞核中的ITGB4能够与ATF3的启动子结合。6.SEC抑制鸡胚尿囊膜移植瘤的生长。6.1 SEC促进肿瘤凋亡,抑制鸡胚尿囊膜移植瘤的生长。6.2 SEC对鸡胚尿囊膜正常的血管生成没有影响,同时SEC不影响血管内皮细胞的成血管作用。7.SEC抑制PC3细胞和HEK293T RKIP-/-细胞的迁移。7.1 SEC抑制RKIP低表达的PC3细胞和RKIP敲除的HEK293T细胞的迁移和EMT过程,对RKIP野生型HEK293T细胞迁移和EMT没有影响。7.2 SEC下调PC3细胞和HEK293T 胞促转移基因CCL2,APLN和IL6ST的mRNA水平,对HEK293T RKIP+/+细胞中这些基因的表达没有影响;HEK293T RKIp-/-细胞中恢复RKIP表达,SEC不能抑制这些基因的表达。8.ANXA7激活AMPK,抑制促转移基因的表达。8.1 SEC促进ANXA7与AMPK的结合,增加AMPK的磷酸化,ANXA7 GTPase抑制剂ABO会明显抑制SEC诱导的二者的结合和AMPK磷酸化水平的上调。8.2 AMPK的激活通过抑制mTORC1,降低STAT3的磷酸化水平,抑制STAT3的核位移,从而抑制其靶向的促转移基因的表达。9.RKIP与ANXA7结合,抑制了 ANXA7 GTPase的激活而介导的信号通路。9.1 HEK293T RKIP+/+细胞中,RKIP 能够与 ANXA7 结合。9.2 HEK293T RKIP+/+细胞中,RKIP与ANXA7的结合,抑制了 SEC诱导的ANXA7与AMPK的结合。10.SEC抑制裸鼠PC-3M-Luc原位肿瘤的转移。10.1 SEC处理显著降低了小鼠活体发光成像的荧光光子数。10.2 SEC处理抑制了肿瘤向淋巴结的转移。结论1.SEC激活ANXA7 GTPase活性,促进ITGB4 Y1494位点磷酸化,诱导ITGB4向细胞核转移。2.进入细胞核中的ITGB4与ATF3启动子结合,促进ATF3表达,进一步激活ATF3下游促凋亡基因PPP1R15A,IL8和TRIB3的表达,促进肿瘤细胞凋亡。3.RKIP低表达的PC3细胞和RKIP敲除的HEK293T细胞中,SEC通过激活ANXA7 GTPase,促进 AMPK 的磷酸化,活化的AMPK通过mTORC1/STAT3通路,抑制STAT3入核。RKIP野生型的HEK293T细胞中RKIP与ANXA7结合,抑制了 SEC对ANXA7 GTPase信号通路的激活作用。4.STAT3入核的抑制会导致STAT3靶向的促转移基因CCL2,APLN和IL6ST表达的下调,从而抑制肿瘤转移。