具有干细胞特性的性原细胞及精原细胞统称为雄性生殖干细胞,这类干细胞可以自我更新维持干细胞库,也可以分化产生精子。精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是唯一可以将亲本遗传信息传递给后代的成体干细胞。SSCs可以分化为精原细胞并起始精子发生,这个过程需要严密的基因表达调控。基因的表达调控受到组蛋白修饰的影响。组蛋白H3和H4的赖氨酸残基上可以发生三种甲基化修饰,包括一、二和三甲基化。通常H3K4和H3K36的甲基化与基因的转录激活相关,而H3K9,H3K27和H4K20的甲基化与转录抑制相关。这些组蛋白的甲基化修饰受到甲基转移酶或去甲基化酶的催化。组蛋白甲基转移酶SETDB1(SET domain,bifurcated 1),也称为ESET,可通过H3K9me2/3调控异染色质的形成,抑制基因表达。SETDB1对于胚胎干细胞的维持、神经细胞的存活具有重要作用。本研究利用蛋白质免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀、组织免疫荧光等技术研究了SETDB1调控小鼠精原干细胞存活的分子机制,以及SETDB1对猪性原细胞存活的调控作用。主要结果如下:(1)Setdb1敲低可引起C18-4细胞线粒体膜电位的下降,细胞膜磷脂酰丝氨酸的外翻及凋亡晚期DNA的断裂,且Setdb1-KD诱导了促凋亡基因Bax、Apaf1、p53、Caspase9表达的上调,抑凋亡基因XIAP表达下调。说明Setdb1干扰可以通过调节凋亡相关基因的表达调控细胞凋亡。(2)Setdb1-KD可激活PTEN,进而抑制AKT及FOXO1的磷酸化。Setdb1及Pten的双敲低可挽救细胞凋亡的发生,且反转了由于Setdb1-KD诱导的凋亡及通路相关蛋白的表达变化。说明了PTEN/AKT/FOXO1通路参与了Setdb1-KD诱导的小鼠精原干细胞凋亡。(3)SETDB1可与AKT相互作用,且SETDB1可以增强AKT对下游靶蛋白FOXO1的调控,抑制FOXO1的入核,从而抑制其自身启动子的转录活性。Setdb1-KD可诱导FOXO1进核,并激活促凋亡基因Bim和Puma的表达。说明SETDB1可以协同AKT调控FOXO1活性并影响下游靶基因的表达。(4)H3K9me3-ChIP结果显示,Setdb1-KD导致了基因Pten、Foxo3和Bim启动子区域H3K9me3水平的降低,而Foxo1、Puma、Bax和Bcl2启动子区域的H3K9me3无显著变化。另外,SETDB1-ChIP显示,SETDB1可以直接结合到Pten、Bim、Puma和Bax基因启动子区域。结果说明,SETDB1只负责部分基因启动子上H3K9me3修饰,且SETDB1可以通过直接作用于Pten及Bim启动子区域催化H3K9me3修饰,从而调控小鼠精原干细胞的存活。(5)在猪睾丸发育过程中,SETDB1的表达量随着猪的发育逐渐升高,而H3K9me3的表达水平在出生7天猪睾丸中表达量最高。在7天和两月龄猪的睾丸组织中,SETDB1在性原细胞和精原干细胞中呈胞质分布,而H3K9me3呈核周分布。在成年猪睾丸组织中,SETDB1定位于精原干细胞和分化的精原细胞的细胞核,而H3K9me3在精原干细胞中呈核周分布,在分化的精原细胞中呈斑点状分布。(6)为了研究SETDB1在猪性原细胞中的功能,通过差异贴壁富集性原细胞,富集后的性原细胞纯度可达到76.5%±3.9%。通过Western及RT-PCR结果发现,SETDB1主要表达于性原细胞。说明SETDB1在调控猪性原细胞的存活上可能发挥着重要功能。(7)SETDB1干扰引起猪性原细胞凋亡,且凋亡的发生不依赖于H3K9me3;另外,SETDB1可与催化H3K27甲基化的甲基转移酶EZH2结合,且SETDB1敲低引起H3K27me3水平的降低,说明SETDB1干扰调控猪性原细胞的凋亡是通过H3K27me3水平调控的。综上所述,通过PTEN/AKT/FOXO1通路及H3K9me3水平,Setdb1-KD诱导小鼠精原干细胞的凋亡;SETDB1协同AKT参与对下游靶蛋白FOXO1的活性调控。同时,SETDB1-KD也诱导猪性原细胞凋亡,但是H3K9me3水平并未改变,而与SETDB1结合的组蛋白甲基转移酶EZH2催化的H3K27me3水平的降低有关。本研究揭示了表观遗传机制和凋亡信号通路之间的关系,并填补了表观遗传调控雄性生殖干细胞存活研究领域的空缺,为今后雄性不育的研究提供了新的思路。