水稻(Oryza sativa L.)是世界上最重要的粮食作物之一,超过1/3的世界人口将其作为主要食物来源,是中国产量最大的粮食作物,年产1.9亿t左右。水稻纹枯病、白叶枯病、稻瘟病是水稻的三大主要病害,对水稻产量造成严重的影响。关于白叶枯病、稻瘟病的研究已经展开的很多,而且很深入。而对于纹枯病的研究不多——纹枯病的致病机理不清楚,而且关于致病基因克隆的报道也很少。本研究通过构建双元质粒pCAMBIA1300sGFP,用农杆菌介导转化水稻纹枯病菌原生质体、菌丝,以潮霉素磷酸转移酶为筛选标记,将外源基因绿色荧光蛋白(GFP)基因导入水稻纹枯病菌基因组。为了制备水稻纹枯病菌原生质体,我们建立了水稻纹枯病菌原生质体制备、再生的最优体系；最佳的原生质体制备条件：通过纤维素酶和崩溃酶的组合对菌龄为12h的菌丝,35℃条件下,以pH5.2,0.6mol/L的硫酸镁为渗透压稳定剂,酶解3h,此条件下得到的原生质体产率高达16.7×108个/g；原生质体再生的最优条件为：在再生培养基RM上,酶解2.5h,菌龄为16h的原生质体,以0.6mol/L硫酸镁为渗透压稳定剂,26℃条件下培养时,再生效果最佳,同时比较了几种再生培养基对再生的影响,其中RM再生率最高,再生率最高可达39%,而IM再生效果相当,但是再生时间要长20h。PSA培养基再生效果不理想,再生效率仅为12%。通过农杆菌介导转化水稻纹枯病菌菌丝和原生质体,获得了6000株转化子；同时对农杆菌转化原生质体、菌丝的转化体系进行了优化,获得了稳定、有效的转化体系,最优转化体系为：农杆菌/原生质体比为200：1,预诱导和共转化同时以200μmol/乙酰丁香酮诱导,24℃下预诱导10h、共转化36h时,获得的转化效率最高,每106个原生质体可以获得600个转化子；通过比较农杆菌介导转化(ATMT)、限制性酶切插入(REMI)、PEG介导转化在转化效率方面的差异,可以得知,三种方法都能获得转化子,但是农杆菌转化效率更高、更为稳定。获得转化子之后,通过正向遗传学分析突变子的表型——菌落形态、菌丝显微观察、生理生化、致病性,为探索控制表型、性状的基因提供丰富的材料。在生长速率方面,大部分突变子的平均生长速率都小于1.00mm/h(标准菌株的平均生长速率为1.34mm/h),其中突变子267的平均生长速率明显变缓,只有0.46mm/h；在致病性方面,276、130、115等突变子的致病性明显减弱,突变子267基本上不致病,而突变子340的致病性较标准菌株明显增强。以双元载体T-DNA的边界序列设计引物,已经获得2个突变子的右边界序列,通过与立枯丝核菌IG1-IA基因组序列进行比对,目前扩增的序列长度有限,无法预测基因功能,但是也为进一步克隆完整的基因序列奠定了基础。另外,将含有GFP基因的突变株侵染水稻,进行荧光显微观察,从亚细胞结构上观察水稻纹枯病菌侵染水稻的过程,与标准菌株侵染水稻相比,突变子的菌丝在荧光显微下可以清楚的看到菌丝发出绿色荧光,为之后观察纹枯病病菌-水稻互作提供了一个可靠的工具。