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硫酸软骨素/硫酸皮肤素（Chondroitin Sulfate/Dermatan Sulfate,CS/DS）是一类直链线性聚阴离子多糖,由重复二糖单位组成。CS二糖单位的结构为由β-1,3糖苷键连接的葡萄糖醛酸（GlcUA）和N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）,二糖单位之间由β-1,4糖苷键连接而成CS的基本糖链骨架;当CS二糖单位中的GlcUA在C-5差向异构酶的作用下变为艾杜糖醛酸（IdoUA）时,形成了 DS二糖单位。其中,GlcUA或IdoUA的C-2、C-3位和GalNAc的C-4、C-6位在硫酸基转移酶的作用下会发生不同程度的硫酸化而形成不同硫酸化模式的二糖单位,从而产生结构高度复杂的CS/DS糖链结构。CS/DS是一类重要的糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）,作为蛋白聚糖（Proteoglycans,PGs）的侧链而存在。CS/DS链的结构高度复杂性赋予了其不同的生物活性,如参与细胞生长,细胞粘附,病毒的侵染,神经系统的发育等等。序列的不均一性,二糖排列的多变,糖醛酸的异构化尤其是硫酸化模式的不同使得CS/DS的结构与功能的研究面临巨大的挑战。CD/DS特异性降解酶作CS/DS结构和功能研究必不可少的工具酶,目前可利用的种类和数量极为有限,尤其是专一性降解DS的酶仅一种被报道,被称作 Chondroitinase B（CSase B）。在本研究中,我们发现并鉴定了两个新型DS特异性裂解酶（DS lyase,DLase）DLase 1和DLase 2。这两个酶与已知CSase B同源性较低,均为内切型裂解酶,最适条件下的酶活远高于CSase B。此外,本课题还首次从比目鱼,绿鳍马面鲀和龙利鱼皮中分离纯化了三种新型的CS/DS,并利用新鉴定DLase对其组成结构进行了分析。具体研究成果如下:1.利用生物信息学方法从GenBank数据库中发现了两个潜在的DS特异性裂解酶疑似基因dlase1（GenBankTM 编号:WP013634816.1）和dlase2（GenBankTM编号:SCH13530.1）,与CSase B的相似度分别为57%和43%。对两个疑似基因及其编码蛋白序列的分析表明:dlase1基因全长为1473 bp,GC含量为49.08%,编码的蛋白包含491个氨基酸,理论分子量为55.35 kDa,pI为8.60,其N端信号肽包含21个氨基酸;dlase2基因全长为1401 bp,GC含量为48.61%,编码的蛋白含有467个氨基酸,理论分子量为52.00 kDa,pI为6.18,其N端信号肽包含19个氨基酸。值得注意的是,尽管两个新酶与CSase B（55.20 kDa）分子量相近,但pI值较低,尤其是DLase2。通过全基因合成,我们对两个疑似基因进行了异源重组表达,SDS-PAGE电泳分析表明,两个蛋白都可以被很好的水溶性表达,表达量分别达到300mg/L和100mg/L,经Ni柱亲和纯化,重组蛋白DLase 1和DLase 2的纯度均大于95%。2.对DLase 1和DLase 2进行底物降解特异性研究、基本酶学性质分析和酶活测定等,发现DLase 1和DLase2与CSaseB相同,只能专一性降解DS。DLase 1的最适反应缓冲液为50 mM Tris-HC1 10.0,最适反应温度为40°C,Ca2+可以显著促进其活性,将不同浓度的Ca2+加入到反应体系中发现,当Ca2+浓度为20mM时对DLase 1活性的促进最强,使之达到未加Ca2+活性的155%;DLase 2的最适反应缓冲液为50 mM Tris-HCl 9.0,最适反应温度为40℃,与DLase 1相似,Ca2+可以显著促进其活性,当Ca2+浓度为20 mM时DLase 2的降解活性达到未加金属离子活性的191%;而CSase B反应的最适缓冲液为50 mM Tris-HCl 8.0,与DLase 1和DLase 2相近,反应的最佳温度为30℃,比DLase 1和DLase 2低。在最适条件下测得DLase 1和DLase 2的酶活分别为911 U/mg和1630 U/mg,远高于CSase B的84.6 U/mg。除此以外,我们还测定了其它GAGs对DLase 1和DLase 2降解DS活性的影响,发现透明质酸（Hyaluronic Acid,HA）、肝素（Heparin,Hep）、硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate,HS）、CS-A 和 CS-C 均可以竞争性抑制DLase 1和DLase 2对DS的降解作用,其中,Hep对其抑制作用最强,这可能是因为Hep富含IdoUA残基的原因。通过对DLase 1和DLase 2的抗性结构分析可知,DLase 1和DLase 2不能降解DS链中含有少量CS结构。3.为了发现和鉴定更多新型的CS/DS,本研究利用蛋白酶解、乙醇沉淀和柱层析等技术从比目鱼,绿鳍马面鲀和龙利鱼皮中分离纯化得到三种新型的CD/DS多糖。凝胶过滤层分析表明:龙利鱼皮CS/DS的平均分子质量为56.24 kDa,绿鳍马面鲀鱼皮CS/DS的平均分子质量为60.52kDa,比目鱼皮CS/DS的平均分子质量为65.19 kDa。进一步,利用CS特异性降解酶CSase AC II和本研究发现的DS专一性降解酶DLase 1对三种新型CS/DS糖链中CS和DS的二糖组成和比例进行了分析。结果表明,尽管三种鱼皮来源的新型CS/DS均含有较高含量的A-unit（GlcUAβ1-3GalNAc（4S））和 iA-unit（IdoAα1-3GalNAc（4S））,但 CS和DS的含量和二糖组成显著不同,为新型CD/DS生物活性研究和开发利用奠定了基础。总之,本研究发现和鉴定了两个新型的DS特异性降解酶,两者的异源表达效率和酶活远高于目前唯一已被报道的DS专一性降解酶CSase B,无疑,在CS/DS结构和功能研究和活性寡糖制备中具有重要的应用价值。同时,三种鱼皮来源新型CS/DS的分离纯化和组成结构分析,为进一步的生物活性研究和相应的资源开发利用提供了可能。