慢性萎缩性胃炎是以胃黏膜固有腺体减少并常伴肠上皮化生、异型增生为病理特点的常见消化系统疾病,在非干预条件下历经胃癌前病变过程可存在胃癌发生的风险趋势,因此对慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变的早期诊断、干预可阻断其向胃癌发展,对于胃癌的防控具有积极作用。多项研究表明,中医药在辨证论治慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变方面具有良好疗效,围绕本病进行的证候学相关深入研究有助于挖掘关键病机、确立临床治疗的核心靶点,从而为治则治法的提出奠定临床理论基础。经团队长期临床及实验研究总结,认为胃癌前病变的病机为本虚标实,本虚以气虚为主,标实为毒瘀互结,由此提出以益气化瘀解毒法为治疗胃癌前病变的基本治则,并在临床观察及动物实验中证实该法可逆转胃癌前病变的有效性。本研究主要分为临床研究与实验研究两部分,临床研究基于横断面收集慢性萎缩性胃炎患者相关信息建立数据库,运用数据挖掘方法探究慢性萎缩性胃炎证候要素分布、证候要素间关联、四诊信息间组合等隐匿规律,并提取关键证候要素后,从临床症状程度、病理征象及心理-社会功能等多方面评价其在本病中的重要作用,为本病核心治疗原则的确立提供理论基础。实验研究基于前期临床观察与动物实验,进一步验证以益气化瘀解毒法为组方的消痞颗粒对胃癌前病变大鼠的一般情况、宏观表征及胃黏膜病理改变的干预情况,并在分子水平上探讨其逆转胃癌前病变基因蛋白信号通路轴的作用机制。第一部分 临床研究目的:基于数据挖掘探讨慢性萎缩性胃炎证候要素相关规律,深入研究关键证候要素在本病中的影响作用。方法:临床采集慢性萎缩性胃炎患者中医四诊信息、胃镜及病理检查报告,构建慢性萎缩性胃炎数据库;采用因子分析、对应分析、隐结构模型、关联规则算法、类神经网络建模的数据挖掘方法分析慢性萎缩性胃炎证候要素分布情况、证候要素间关联性、慢性萎缩性胃炎核心症状以及重要病理改变与证候要素间相关性,并提取关键证候要素。根据关键证候要素的有无将慢性萎缩性胃炎患者进行分组,探究关键证候要素在临床症状程度、病理征象及心理-社会功能等方面的影响作用,确立本病核心病机及治则治法。结果:1.基于数据挖掘的慢性萎缩性胃炎证候要素分布规律研究(1)因子分析的证候要素提取显示,慢性萎缩性胃炎证候要素包括气虚、湿、热、血瘀、气滞、阴虚、阳虚,证候要素分布由多至少依次为湿>气滞>热>血瘀>气虚>阴虚>阳虚(P<0.05)。(2)对应分析显示,两两证候要素中,气虚与气滞、气虚与阳虚、湿与热、血瘀与气滞、血瘀与阳虚、气滞与阳虚的关联性较高。(3)关联规则分析显示,将出现频率为10%以上的59个四诊信息条目通过Apriori算法得到的慢性萎缩性胃炎核心四诊信息包括胃刺痛、口臭、纳差、咽部异物感等共12个,涵盖证候要素血瘀、热、湿、气滞、阳虚与气虚。(4)隐结构模型分析的证候要素提取显示,慢性萎缩性胃炎证候要素包括气虚、湿、热、血瘀、气滞、阳虚。(5)类神经网络分析预测证候要素湿、血瘀、气虚对重要病理改变异型增生的影响较大。2.慢性萎缩性胃炎重要证候要素湿与血瘀的影响探讨(1)在胃黏膜病理情况分布上,证候要素湿对Hp感染呈正相关(P<0.05);证候要素血瘀对异型增生呈正相关(P<0.05)。(2)在胃黏膜病理积分分布上,四分组各组间Hp积分、病理总积分存在统计学差异(P<0.05)。(3)在症状积分分布上,四分组各组间主要症状积分、症状总积分存在统计学差异(P<0.05)。(4)在慢性胃炎PRO量表积分分布上,四分组各组间生理领域积分、PRO总积分存在统计学差异(P<0.05);各组间在独立性领域、心理领域、社会环境领域以及生活质量评分方面无统计学差异(P>0.05)。(5)四分组各组间不同病程阶段病例分布存在显著统计学差异(P<0.05),从萎缩阶段到异型增生阶段纯瘀组患病例数呈上升趋势,纯湿组患病例数呈下降趋势,非湿非瘀组与湿加瘀组患病例数基本持平,但组别与病程阶段不存在相关性(P>0.05)。(6)异型增生积分对于证候要素湿的预测影响较大,异型增生程度较轻,则湿存在的可能性较大;异型增生积分、肠化积分与活动性积分对于证候要素血瘀的预测影响较大,异型增生程度较重且肠化程度相对较轻,则血瘀存在的可能性较大。结论:慢性萎缩性胃炎证候要素主要为气虚、湿、热、血瘀、气滞、阴虚、阳虚,其中气虚是贯穿整个病程的基本证候要素,湿与血瘀对病情程度及进展有重要作用;针对气虚为本,毒瘀致变的核心病机所提出益气化瘀解毒法体现了对慢性萎缩性胃炎及胃癌前病变关键证候要素靶点的囊括,为其临床逆转胃癌前病变、预防胃癌的有效性提供了证候学依据。第二部分 实验研究目的:建立胃癌前病变大鼠实验模型,探讨益气化瘀解毒法对该模型大鼠一般情况、宏观表征及胃黏膜病理变化的干预情况,进一步探讨益气化瘀解毒法对胃癌前病变大鼠miR-21-PTEN-PI3K/AKT信号通路的影响。方法:70只SPF级健康雄性Wistar大鼠随机分为空白组10只,模型组60只。空白组给予SPF级动物标准饮食喂养,持续至实验结束。造模组采用以200μg/mL的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)溶液灌胃,每只5 mL/kg 1次/d为主,配合自由饮用0.05%氨水溶液及食含0.03%雷尼替丁的颗粒状饲料,三种因素联合建立胃癌前病变大鼠模型。44周末造模成功后将造模组剩余的41只大鼠根据体重因素按照计算机生成随机数字法分为三组,均给予SPF级动物标准饮食喂养。模型组予生理盐水3mL/kg灌胃,1次/d;维酶素组予维酶素悬浊液2mL/kg(即维酶素0.3g/kg)灌胃,1次/d;消痞颗粒组予消痞颗粒混悬液3mL/kg(含生药9g/kg)灌胃,1次/d。治疗持续时间12周后,所有实验大鼠于第56周末处死。造模阶段和干预阶段均观察大鼠一般情况、宏观表征情况。干预阶段结束后采用普通HE染色观察各组大鼠胃黏膜病理情况,同时选用RT-PCR对各组大鼠miR-21、PTEN基因进行检测,采用ELISA法对各组大鼠AKT、PI3K蛋白表达进行检测。结果:1.益气化瘀解毒法对PLGC大鼠干预的作用(1)在造模阶段,模型组大鼠一般情况与表征明显差于空白组;在干预阶段,消痞颗粒组与维酶素组大鼠宏观表征均优于模型组,尤以消痞颗粒组明显,模型组宏观表征改善不明显。(2)在造模阶段,模型组大鼠于实验第34周出现胃黏膜萎缩,于实验第38周出现趋于异型增生改变,于实验第44周出现异型增生。在干预阶段,各组间大鼠的胃黏膜厚度、黏膜肌层厚度、比值间均具有统计学差异(P<0.05)。胃黏膜改变程度在不同组别上的具有统计学差异性(P<0.05)。模型组大鼠胃黏膜持续萎缩,伴有异型增生,消痞颗粒组大鼠的病理变化情况明显优于模型组(P<0.05),主要体现在改善慢性炎症及异型增生方面;维酶素组病理改变情况较模型组无统计学差异(P>0.05)。(3)干预后各组大鼠的表征积分与病理总积分呈较强的正相关(P<0.05)。2.益气化瘀解毒法对PLGC大鼠miR-21-PTEN-PI3K/AKT信号通路轴的效应机制(1)各组miR-21、PTEN基因、AKT蛋白、PI3K蛋白表达均存在统计学差异(P<0.05)。各组miR-21表达比较,模型组表达最高,其次是维酶素组,消痞颗粒组表达最低;各组PTEN基因表达比较,消痞颗粒组表达最高,其次是空白组,模型组表达最低;各组AKT、PI3K蛋白表达比较,模型组表达最高,其次是维酶素组,空白组表达最低。(2)miR-21与PTEN基因表达呈负相关(P<0.05),与PI3K、AKT蛋白表达呈正相关(P<0.05);PTEN基因表达与PI3K蛋白表达呈负相关(P<0.05);PI3K与AKT蛋白表达呈正相关(P<0.05)。(3)采用多重线性回归分析结果提示大鼠病理总积分与PI3K蛋白表达具有较强相关性。结论:以益气化瘀解毒法组方的消痞颗粒可有效改善胃癌前病变大鼠的一般情况、宏观表征,逆转胃癌前病变病理变化,阻断胃癌发生;并且通过抑制miR-21异常表达来调控PTEN基因,从而对PI3K/AKT信号通路进行干预来逆转胃癌前病变的发生,可能是其防治胃癌的有效作用机制之一。