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背景：目前,工业应用的天然产物主要来源于生物组织(动物、植物和微生物)的初级代谢产物和次级代谢产物。随着筛选、分离、纯化技术的提升,目前已有超过一百万种天然产物被科研工作者发现。所有报道的天然产物中,约有20-25%的天然产物具有生物活性,目前发现的来源于微生物的22500个具有生物活性的化合物中,约有45%来源于放线菌,38%来源于真菌,17%来源于单细胞细菌。这些真菌来源的活性化合物大多数来源于丝状真菌的次级代谢产物,如p内酰胺类抗生素、灰黄霉素、夫西地酸、环孢霉素、杀菌剂和他汀类药物等。近年来的研究显示,丝状真菌的次级代谢调控是一个由大量全局性调控因子和途径调控因子组成的多层次的调控过程,如全局性调控因子LaeA和途径调控因子AflR可共同参与调控构巢曲霉中柄曲霉素的生物合成。全局性调控因子VeA是1965年于构巢曲霉中发现的分生孢子抑制因子,目前已在黄曲霉、烟曲霉和产黄青霉等多种丝状真菌中发现了VeA同源蛋白的存在。随后研究发现VeA在丝状真菌中的调控作用具有光依赖性,基于VeA的光依赖调控研究发现VeA通过与VelB形成VeA/VelB复合物参与丝状真菌的生长发育调控；而VeA/VelB可与LaeA结合形成VelB/VeA/LaeA复合物参与丝状真菌的次级代谢调控。基于velvet复合物的研究在多种丝状真菌中均显示velvet家族的VosA、VelC和LlmF等蛋白的存在。这些研究提示VeA和其同源蛋白或蛋白复合物具有类似的调控丝状真菌次级代谢和生长发育的功能。橘青霉作为美伐他汀的工业生产菌株,已得到广泛应用和研究。但橘青霉次级代谢生物合成的调控研究还很少,美伐他汀的生物合成调控也仅限于生物合成基因的解析,对于橘青霉次级代谢产物的全局性调控研究几乎未见报道。我们实验室报道了全局性调控因子LaeA可参与调控美伐他汀的生物合成,同时也克隆并分析了橘青霉veA基因的全长序列。探究VeA对橘青霉美伐他汀生物合成、生长发育和应激反应的调控机制是很有必要的,本课题在克隆橘青霉可能的全局性调控因子veA的基础上,通过农杆菌介导转化平台构建了橘青霉veA过表达菌株,旨在研究橘青霉中veA的全局性调控功能。目的：通过农杆菌介导转化方法构建了橘青霉veA过表达菌株,旨在通过比较橘青霉野生菌株(WT菌株)和veA过表达菌株(OE::veA菌株)之间的美伐他汀产量差异、生长发育差异和渗透压等耐受反应差异来探究veA对橘青霉次级代谢、生长发育和应激反应的调控机制。方法：1.采用RT-PCR方法从橘青霉cDNA克隆得到veA全长,酶切后连接到pGiHTGi载体上,获得pGiHTGi-veA载体。采用PCR、酶切和测序等手段对所构建载体进行验证。随后,将验证完毕的pGiHTGi-veA转入农杆菌LBA4404中,通过农杆菌介导转化体系构建OE::veA菌株,并利用潮霉素基因PCR筛选和抗性筛选对菌株进行验证。2.利用RT-qPCR对WT菌株和OE::veA菌株的veA转录水平进行分析,同时对光照(3000lux)和黑暗条件下橘青霉中veA的转录差异进行分析。3.通过显微镜观察和菌落培养比较WT菌株和OE::veA菌株在光照和黑暗两种培养条件之间的菌丝、菌落和孢子产量差异。同时,通过RT-qPCR技术对各种条件下的分生孢子形成相关基因abaA基因和brlA基因的转录差异进行比较。4.将WT菌株和OE::veA菌株于PGA液体培养基中连续发酵8d,并通过HPLC手段对美伐他汀每天的生物合成量进行过程分析,同时利用RT-qPCR技术对发酵初期菌体中美伐他汀生物合成基因mlcB和途径调控因子mlcR的转录差异进行分析,从而研究veA对美伐他汀生物合成的影响。5.通过Nac1、Kc1、Glucose和H2O2等的耐受培养,对WT菌株和OE::veA菌株的菌落直径大小和孢子产量的差异进行分析,并利用RT-qPCR技术分析橘青霉中可能参与应激反应的trxB基因的转录水平。结果：1.成功构建pGiHTGi-veA重组载体,通过农杆菌介导转化平台,利用潮霉素抗性标记成功筛选到了veA过表达菌株OE::veA菌株。2.veA抑制橘青霉的无性繁殖发育。OE::veA菌株的菌落颜色较WT菌株浅；OE::veA菌株的菌丝发育较WT菌株慢；OE::veA菌株的孢子产量均较WT菌株少；OE::veA菌株中无性繁殖相关基因abaA和brlA的表达量也较WT菌株低；而OE::veA菌株中veA的表达量较WT菌株高。3.光照抑制橘青霉生长,促进veA基因的转录。光照条件下,橘青霉菌株(WT菌株和OE::veA菌株)较黑暗条件生长缓慢,且孢子产量也较黑暗条件少。同时,WT菌株和OE::veA菌株的veA表达量在光照条件下均会较黑暗条件有显著增加。4.veA促进美伐他汀生物合成。发酵前4天,WT菌株的美伐他汀积累量为39.96mg/L,OE::veA菌株的美伐他汀积累量为115.88 mg/L,此过程OE::veA菌株中的mlcR和mlcB表达量均较WT菌株高。随后WT菌株的产量不再增加,而OE::veA菌株的产量会呈现下降趋势,到第8天,OE::veA菌株的发酵液中美伐他汀含量将降至约68mg/L。发酵过程WT菌株和OE::veA菌株的菌体干重趋势无显著差异。5.veA与橘青霉的环境应激相关。Nacl、Kcl和Glucose培养条件下,WT菌株和OE::veA菌株的孢子产量差异会消失,甚至会呈现出OE::veA菌株孢子产量超过WT菌株的现象。H202培养条件下,OE::veA菌株对H202的耐受浓度较WT菌株耐受浓度提高约5mM。应激耐受基因trxB分析表明随着培养时间的增加,OE::veA菌株中trxB的表达量比较稳定,WT菌株中trxB的表达量呈下降趋势。结论：光照能通过促进橘青霉中veA的表达以到达抑制橘青霉生长发育的效果。veA过表达会导致veA表达量增加,同时导致橘青霉生长发育和无性繁殖受到抑制,而光照能增强此调控过程。veA能正向调控美伐他汀生物合成。veA可增强橘青霉对Nacl、Kcl和H202等的耐受。橘青霉中很可能存在一个基于以veA为核心的velvet家族调控网络,此网络可同时将次级代谢调控、生长发育调控和对渗透压等外界压力耐受反应调控联系起来。橘青霉全局性调控因子veA对美伐他汀的生物合成、橘青霉分生孢子形成和外界环境的应激反应的调控作用的研究将为开发美伐他汀高产菌株和橘青霉次级代谢产物提供理论依据。