防御素是一种广泛存在于动植物界的抗菌多肽。人类防御素是一种存在于血液、肠道及表皮细胞的富含精氨酸的阳离子多肽。防御素分子具有特殊的空间结构，分子中含有6个半胱氨酸残基，分别形成3对二硫键。其中，hβD—3由45个氨基酸残基组成，对多种病原体和一些有耐药性的微生物都有相当强的抗性。同时，hβD—3还参与了人体天然免疫和获得性免疫的反应。与其他防御素分子相比，hβD—3分子不具有明显的细胞毒性，而且对盐离子浓度不敏感，是一种很有前途的优秀的抗菌多肽。 本论文主要研究了hβD—3基因在大肠杆菌细胞中的表达策略。采用pET—30a(+)载体进行基因非融合表达；采用pET—32a(+)载体进行基因融合表达。其中，在非融合表达hβD—3基因的研究中，为提高hβD—3基因表达的稳定性和表达量，设计了独特的多顺反子表达框。 在非融合表达部分，首先对pET—30a(+)载体进行了结构改造，利用T7启动子与下游标签序列之间的酶切位点NdeⅠ以及多克隆位点上的NcoⅠ位点，切除了载体上原有的融合序列(S·Tag和His·Tag)。用改造的新载体成功实现了对N-βD—3蛋白的非融合表达。 在多拷贝表达框的设计策略方面，本研究为每个拷贝的基因单独设计了起始密码ATG和终止密码。设计中还特别添加了基因转录所必须的SD序列，从而构成了每个基因的独立表达单元，即表达框。使每段基因都能够单独表达。hβD—3基因及其具有2～3个完整表达框的串联基因的表达量分别为23.87μg/mL、40.24μg/mL、64.09μg/mL。同时，为避免直接表达得到的蛋白产物对宿主细胞产生毒性，非融合蛋白N-βD—3以包涵体形式表达。 以包涵体形式表达完成后，经过变性与复性的操作过程，使目标产物恢复成为有活性的蛋白，N-βD—3(1×)、N-βD—3(2×)、N-βD—3(3×)蛋白复性率分别达到26.7％、26.3％、26.4％；复性后得到N-βD—3(1×)、N-βD—3(2×)、N-βD—3(3×)的量分别为15.49μg/mL、20.59μg/mL、26.51μg/mL。通过对大肠杆菌K12D31的抑菌实验鉴定，复性后均为有活性的重组蛋白。 本研究还应用pET—32a(+)载体在BL21(DE3)溶原菌中进行了F-βD—3蛋白的融合表达，表达量达到127.23μg/mL。融合蛋白经镍柱亲和层析与肠激酶酶切后，有一定损失，最终得到hβD—3蛋白的量为18.17μg/mL。经对大肠杆菌K12D31的抑菌实验鉴定，肠激酶酶切后产物为有抑菌活性的重组hβD—3蛋白。