论文部分内容阅读
目的：通过上、下调人肝癌HepG2细胞株中miR-101表达,干扰靶基因EZH2,探讨miR-101对肝癌细胞增殖与凋亡影响。方法：1.采用细胞体外培养方法培养人肝癌HepG2细胞株,人工合成miR-101mimics (模拟体)及miR-101inhibitor(抑制剂)并通过脂质体Lipofectamine2000转染至HepG2肝癌细胞株中,在倒置荧光显微镜下观察转染效率。2.采用MTT比色方法检测经转染后miR-101mimics组及相应N.C组、miR-101inhibitor组及相应inhibitor N.C组、空白对照组细胞增殖活性,绘制生长曲线进行比较分析miR-101对人肝癌HepG2细胞增殖的影响。3.采用流式细胞仪检测转染后miR-101mimics组及相应N.C组、miR-101inhibitor组及相应inhibitor N.C组、空白对照组细胞周期时相和Annexin V-FITC法检测各组细胞凋亡分布,分析miR-101对人肝癌HepG2细胞生长周期与细胞凋亡的影响。4.使用细胞RNA提取试剂盒提取总RNA,采用实时荧光定量-PCR万法,以β-Actin作为内参,测定通过上、下调miR-101表达干扰人肝癌HepG2细胞中EZH2基因的表达情况。结果：1.MTT比色法检测阴性对照组增殖未见明显抑制,而]miR-101mimics转染组细胞增殖抑制明显(P<0.05),miR-101inhibitor转染组细胞增殖较空白对照组及N.C组明显(P<0.05),组间差异有统计学意义(F=17.397,P<0.01)。2.流式细胞仪检测转染48h后miR-101mimics组Go/G1期细胞数(74.71±4.6)%比N.C组(64.89±4.1)%多(x2=353.049,P<0.01),S期细胞数(14.57±1.1)%比N.C组(23.13±2.5)%少(x2=357.650,P<0.01),两组比较差异有统计学意义；miR-101inhibitor组Go/G1期细胞数为(52.99±5.1)%,S期细胞数(32.14±2.3)%,而inhibitor N.C组Go/G1期为(65.70±3.6)%,S期为(19.98±1.7)%,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。3.流式细胞仪分析细胞凋亡结果,发现转染48h后niR-101mimics组凋亡率(29.0±4.4)%比N.C组(22.0±1.3)%和空白对照组凋亡率(24.0±2.7)%高；miR-101inhibitor组凋亡率(11.0±1.8)%较inhibitor N.C组(28.5±2.5)%和空白对照组凋亡率(24.0±2.7)%低。阳性组与阴性对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。4. HepG2细胞转染miR-101mimics48h后,EZH2mRNA表达水平(0.62±0.03)较N.C组(1.04±0.30)及空白对照组(1.31±0.35)显著降低；转染miR-101inhibitor组EZH2mRNA (1.57±0.25)较inhibitor N.C组(0.98±0.12)表达增高(P<0.05)。组间比较差异有统计学意义(F=6.477,P<0.01)。阴性组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论：1.上调miR-101表达,随时间推移,呈明显抑制肝癌细胞增殖趋势,下调miR-101表达,则促进细胞增殖。2. miR-101高表达导致人肝癌HepG2细胞生长周期停滞于G0/G1期,使细胞增殖活性下降,诱导凋亡增加；miR-101低表达,癌细胞增殖活性上升,S期DNA合成期细胞增多,促进肝癌细胞增殖,抑制细胞凋亡3.miR-101高表达在肝癌细胞中可抑制EZH2mRNA表达；miR-101低表达,则EZH2mRNA表达增高,验证了EZH2为miR-101的靶基因,受miR-101负调控。