研究目的：　　流行病学调查研究表明女性绝经后心脏疾病发生率增高，主要原因是雌激素水平下降导致的机体炎性反应增加，糖代谢、脂代谢异常，血管内皮功能受损。与此同时，绝经后女性心血管疾病及代谢综合征相关并发症的致残率和致死率也同样增加，特别是合并其他疾病时，预后不良，生活质量严重下降。　　人类肠道中有着数以万计的肠道微生物。它们与宿主互利共生并且在宿主稳态中起着关键作用。肠道微生态失衡并不仅仅影响的是肠道本身，而是对宿主整个系统都会产生严重影响。研究表明，在肥胖、雌激素缺乏等条件下，机体肠道微生态失衡。另一方面，肠道微生态失调会通过营养代谢、免疫或代谢产物等途径影响心血管健康。上述研究提示，雌激素缺乏条件下，肠道微生物失衡可能是其心脏功能出现异常的重要机制。然而雌激素缺乏条件下，肠道微生物为什么会出现异常？纠正肠道微生物异常能否改善相关心脏功能损害？如何才能纠正肠道微生物异常呢？　　本研究通过构建OVX小鼠模型，明确雌激素缺乏状态下，小鼠心脏功能、肠道菌群、炎症及miRNA的改变。利用超声常规心脏功能评价手段和应变等新技术的优势，结合16S rRNA测序菌群分析等手段，明确粪便miR155、肠道菌群和绝经后妇女心脏功能的改变；在此基础上，通过构建肠道特异的miR155递送策略，增加OVX小鼠肠道miR155表达，明确该策略改变肠道菌群以及对心脏功能的影响；最后探讨该策略可能是通过调整机体炎症状态改变心脏功能。本项目明确肠道菌群紊乱在雌激素缺乏相关心脏损害中的作用，建立一种不依赖于菌群移植和雌激素补偿的新治疗策略。　　研究内容与方法：　　（1）观察雌激素缺乏后，小鼠心脏功能、肠道菌群、炎症及miRNA的改变　　①采用C57/BL6雌性小鼠建立OVX小鼠及对照组模型，各组小鼠为12周龄，建模后正常饮食饲养8周以上进行心功能等观察。　　②利用小动物超声采集心脏收缩以及舒张功能指标；称量各组小鼠体重，取小鼠各部分脂肪后称重，检测脂肪以及心脏内炎性因子水平，并对脂肪切片，进行HE染色。对心脏切片，进行DHE染色。　　③收集OVX小鼠与对照组小鼠结肠段粪便，利用高通量测序对粪便进行菌群多样性组成谱进行分析，比较组间菌群多样性、菌群物种分类组成、特定菌种目、科、属、种水平间的差异性。　　④对OVX小鼠及对照组小鼠肠道及粪便中高丰度表达的17种miRNA进行筛选，比较组间候选microRNA的差异；并利用qPCR检测粪便中所筛选出的miRNA的差异。　　（2）检测绝经女性粪便miR155、乳酸杆菌和心脏功能的改变　　根据绝经和非绝经女性健康志愿者各10名，同期招募年龄匹配的男性健康者20例作为对照。实验前，规范化饮食一周，随后利用超声心动图对其进行全面心脏功能评价，包括常规心脏收缩、舒张功能指标、应变及应变率。观察各指标与性别、年龄与是否绝经之间的相关关系，探索性别、年龄、是否绝经等因素对心脏功能的影响。收集分组后健康志愿者的粪便，提取粪便中的RNA并进行miRNA反转录，比较不同分组间miR155含量的差异。同时，利用qPCR检测粪便中乳酸杆菌的相对丰度。　　（3）探讨miR155改变肠道菌群丰度的机制　　①将大肠杆菌与连接FITC荧光标记的miRNA在有氧条件下，LB固体培养基中，37℃条件下共培养4小时后，进行固定并用DAPI将核进行染色，用共聚焦荧光显微镜.分析大肠杆菌吞噬miRNA的能力。　　②体外培养乳酸杆菌及大肠杆菌菌株，然后将miR155、其他miRNA及NC分别和乳酸杆菌及大肠杆菌共培养后，OD值检测确立不同miRNA对细菌生长的调控以及细菌吞噬不同miRNA的能力。　　（4）结肠靶向递送miRNA策略的构建及递送效果分析　　①基于Eudragit S构建靶向递送miRNA微球及其效率验证。将Eudragit S以及Chitosan在有机溶剂中充分溶解后，按照一定比例混合，进行过滤后加入外源性线虫microRNA，也就是cel-miR-54，并进行磁力搅拌，制成包裹miRNA、大小约为1-2μm的微球。胃饲上述微球，收集粪便及不同组织样本，通过qPCR明确其肠道缓释效果及到达其它脏器的脱靶效应。　　②制备包裹NC及miR155的微球，对小鼠进行灌胃，每周2次，4周后处死部分小鼠，取出其结肠处粪便，利用高通量测序对粪便进行菌群多样性组成谱进行分析，比较组间菌群多样性、菌群物种分类组成、特定菌种目、科、属、种水平间的差异性。评价小鼠体内递送外源性microRNA对菌群的干预效果。8周后评价剩余小鼠心脏功能以及组织炎性反应。　　③在正常小鼠进行miR155以及NC微球悬液灌胃的基础上，联合进行正常小鼠粪便移植处理，保证每组小鼠5只以上，持续4周，8周后利用超声心动图对小鼠进行心脏功能评价，观察组间心脏功能各项指标的差异性。检查结束后，同时进行脂肪炎症和心脏组织学检测。　　（5）探讨靶向递送拮抗肠道miR155对OVX模型心脏功能以及菌群的影响　　探讨靶向递送miR155拮抗剂改善OVX小鼠心脏功能的效应。构建OVX及对照组小鼠模型，对OVX小鼠进行miR155拮抗剂或NC微球悬液灌胃，每周2次，持续4周。处死部分小鼠，取出盲肠处粪便，利用高通量测序对粪便进行菌群多样性组成谱进行分析，比较组间菌群多样性、菌群物种分类组成、特定菌种目、科、属、种水平间的差异性。评价小鼠体内递送外源性miR155拮抗剂对菌群的干预效果。剩余小鼠继续进行miR155拮抗剂或NC微球悬液灌胃，8周后利用超声心动图对剩余小鼠进行心脏功能评价，观察组间心脏功能各项指标的差异性。检查结束后，同时进行脂肪炎症和心脏组织学检测。　　研究结果：　　（1）雌激素缺乏后，小鼠心脏功能、肠道菌群、脂肪炎症及肠道miRNA表达等发生改变　　OVX组小鼠心脏收缩功能下降，心脏组织中炎性因子以及氧化应激水平增加。肠道上皮内miR155水平增加。粪便中厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度增高，在细菌属水平，厚壁菌中乳酸杆菌这一益生菌在OVX组中显著降低。　　（2）绝经期女性粪便miR155、乳酸杆菌和心脏功能的改变　　绝经期女性与非绝经期女性相比，心脏收缩功能和舒张功能均一定程度减低。而年龄匹配男性受试者未观察到上述差别。绝经期女性乳酸杆菌含量降低，而粪便中miR155的相对水平在绝经期女性表达较高；二者有显著相关。由于样本量小和心脏功能众多影响因素，本研究尚未看到菌群与心脏功能之间的相关性。　　（3）miR155通过调控乳酸杆菌增殖调控菌群丰度　　microRNA能够被细菌胞吞，进入细菌并调节细菌增殖能力，而miR155进入乳酸杆菌后显著抑制乳酸杆菌的增殖能力。　　（4）结肠靶向递送miRNA策略的构建及其效果分析　　Eudragit S微球可以高效递送miRNA至肠道。结肠靶向递送miR155增加肠道miR155水平后可以减少肠道菌群中乳酸杆菌的含量，部分降低心脏功能。但对小鼠体重以及肠道细菌门类相对丰度作用不明显。内脏脂肪组织中TNFα，MIP1和MCP1等炎性因子表达水平明显增高。心脏组织中TNFα和MCP1表达水平增高。结肠靶向递送mi155策略可以部分模拟OVX表型。　　在给正常小鼠结肠靶向递送miR155的基础上，进一步进行正常小鼠菌群移植，心脏功能有所恢复、心脏及内脏脂肪组织炎性反应均有降低。说明正常小鼠菌群移植能够逆转结肠靶向递送miR155的作用。　　（5）探讨靶向递送干预miR155对OVX模型心脏功能以及菌群的影响　　肠道特异的miR155拮抗剂递送系统干预OVX小鼠肠道miR155表达后，可以增加乳酸杆菌的含量，但肠道菌群门类相对丰度未见明显变化。同时结肠靶向递送miR155拮抗剂组的OVX小鼠内脏脂肪及心脏组织中TNFα，MIP1和MCP1等炎性因子表达水平显著降低，心脏氧化应激水平降低，心脏收缩功能有所恢复。　　研究结论：　　（1）小鼠OVX条件下，由于雌激素信号的改变，宿主肠上皮分泌更多miR155，肠道菌群丰度较对照组差异明显，厚壁菌门降低，拟杆菌门增高，乳酸杆菌等益生菌的比例降低，机体脂肪和心脏组织的炎性反应增加，最终导致心脏功能下降。临床绝经女性呈现相似变化。　　（2）miR155能够被乳酸杆菌所吞噬,吞噬miR155的乳酸杆菌的增殖能力降低。　　（3）靶向肠道微球递送miR155可以部分模拟OVX表型，菌群移植可以使递送外源性miR155所引起的一系列改变得到恢复。　　（4）通过靶向肠道微球递送miR155拮抗剂可以纠正菌群紊乱，进而减少系统炎症，能够作为一种治疗手段来保护雌激素缺乏状态下心血管功能。