复方甘草酸苷片(compound glycyrrhizin tablets)是由甘草酸单铵盐(glycyrrhizin,GL),甘氨酸(glycine,GLY),DL-蛋氨酸(DL-methionine,MET)组方的复方制剂,疗效确切,临床应用广泛,在肝病领域主要用于治疗慢性肝病,改善肝功能,在非肝病领域用于过敏性反应(如皮疹、荨麻疹、药物疹)、小儿异位性皮炎、扁平苔藓、系统性红斑狼疮、肾综合征出血热及传染性非典型肺炎(SAS)等。本课题临床前研究已完成复方甘草酸苷片的处方工艺研究,质量标准研究,稳定性考察及家兔体内生物等效性评价等工作,并获得国家食品药品监督管理局的临床批件(批件号:2006L01472)。在此基础上,拟进行复方甘草酸苷片工业化生产的处方工艺优化和质量标准修订,试生产和质量评价,人体生物等效性评价,以及GL的体外代谢研究等。以期通过本复方制剂的开发成功,为慢性肝炎的临床治疗提供国产新制剂;同时,从代谢途径研究复方制剂减毒增效的作用机理,为GL的体内代谢研究和临床安全用药评价奠定实验基础。第一部分、复方甘草酸苷片工业化生产的处方工艺参数优化和质量评价。首次建立了在同一色谱条件下检测三个成分的含量,溶出度和有关物质的HPLC法(PDA检测器),该法简便、灵敏、专属性强,重复性好,可将各破坏条件下的降解产物与主成分峰完全分离;优化了复方甘草酸苷片工业化生产的处方工艺参数,完成了试生产;深入进行了有关物质研究,三批试生产产品中的有关物质与原料药,加速试验放置6个月样品以及市售产品美能进行对比,经统计学分析,均有P>0.05,说明制剂过程中和加速放置6个月过程中没有使药物间、药物与辅料间产生明显的未知物,与美能相比也未增加新的有关物质,为有关物质限度的确定提供了翔实的依据;按临床批件要求和2005版《中国药典》规范修订质量标准,与日本进口产品美能(Stronger Neo-minophagen C,SNMC)的质量标准相比,分析方法更具先进性和可靠性,提升了质量标准,可有效控制复方甘草酸苷片的质量;对试生产产品进行了质量评价和稳定性考察,结果表明,复方甘草酸苷片工业化生产的处方合理,工艺稳定。第二部分、按《药品注册管理办法》和临床研究规范的有关要求,评价复方甘草酸苷片在健康人体的生物等效性。采用液相色谱-串联质谱法(LC/MS/MS)测定血浆中GL的代谢产物甘草次酸(Glycyrrhetinic Acid; GA)的浓度,美能为参比制剂,22名健康男性受试者自身交叉单剂量口服治疗剂量试验制剂与参比制剂,血浆样品经液-液萃取,内标为人参皂苷Rh2,经方法确证表明建立的检测方法快速,灵敏、重现性好、专属性强,内源性物质不干扰待测物的测定,样品前处理简便。采用DAS2.0药动学统计软件计算药动学参数,受试制剂和参比制剂的主要药动学参数为:AUC0-∞分别为(5794±3129)ng·h·ml-1和(5621±2752)ng·h·ml-1,AUC0-t分别为(5084±2191)ng·h·ml-1和(5187±2367)ng·h·ml-1,Cmax分别为(288±249)ng·ml-1和(287±160)ng·ml-1,tmax分别为(13.5±6.0)h和(16.7±7.2)h,t1/2分别为(13.1±8.5)h和(10.3±5.65)h,受试制剂相对生物利用度为(95.8±20.8)%。主要药动学参数AUC0-∞、AUC0-t、Cmax对数转换后进行方差分析,双单侧t检验和(1-2α)置信区间法进行生物等效性评价,其中tmax采用非参数检验法,结果均显示试验制剂与参比制剂间无统计学意义(P>0.05),试验制剂与参比制剂AUC0-t,Cmax比值的90%可信区间分别为85.4%～122.3%,80.9%～106.0%,均在AUC0-t,Cmax90%可信区间的80%～125%,70～143%范围之内。结果表明试验制剂与参比制剂具有人体生物等效性。第三部分、GL和GA在大鼠肝微粒体的体外代谢研究。本文建立了Sprague-Dawley大鼠肝微粒体体外代谢模型,苯巴比妥为诱导剂,按80mg·kg-1剂量腹腔注射3天,超速离心法制备肝微粒体,Bradford法测定蛋白浓度,分别以Phenacetin,Clivorine,Propofol作为探针底物进行肝微粒体的CYP450酶,酯酶和肝微粒体II相酶(UGT)的活性表征,证实了肝微粒体代谢模型和酶活性的有效性;本文首次建立了超高效液相色谱-质谱联用技术(UPLC/MS)同时测定GL,GA及其代谢产物,该法快速,灵敏、重现性好、专属性强,并通过质谱峰对代谢产物峰进行了定性和结构推证;在肝微粒体CYP450酶,酯酶和肝微粒体II相酶(UGT)孵育体系中以GL为底物进行温孵,没有检测到3-单葡萄糖醛酸甘草次酸(18β-glycyrrheticacid-3-O-β-D-monoglucuronide,GAMG)或其它任何代谢产物,即β-NADPH,UDPGA对GL代谢没有催化作用,该结果首次提供了CYP450酶,酯酶和肝微粒体II相酶(UGT)对GL无代谢的直接证据,国内外未见报道;在肝微粒体酯酶孵育体系中以GA为底物进行温孵,发现酯酶对GA无代谢;在肝微粒体CYP450酶孵育体系中以GA为底物进行温孵,检测到GA的五个羟化代谢产物(M1,M2,M3,M4,M5,m/z487,485)和一个未知代谢产物(M6,m/z501),NADPH对GA的代谢有催化作用,为NADPH依赖性的氧化代谢机理,该结果发现了在CYP450酶孵育体系中GA代谢生成M1,M2,M3,M4,M5,M6的代谢途径,比现有文献报道的两个羟化代谢产物有更深入的发现;在大鼠肝微粒体II相酶(UGT)孵育体系中以GA为底物进行温孵,发现GA与葡萄糖醛酸结合后生成GAMG和GL,即UGPDA对GA的代谢有催化作用,为UGPDA依赖性的代谢机理,首次发现GA在大鼠肝微粒体温孵体系中与葡萄糖醛酸结合,此现象国内外尚未见报道;同时,在研究中还观察到UGT能使GA经过CYP450代谢的代谢产物进行II相酶代谢,产生3个结合产物M1’,M2’,M3’(m/z 664)的新代谢途径;在肝微粒体孵育体系中加CYP450酶化学抑制剂以鉴定参与GA代谢的CYP450亚酶,选择在药物代谢中起主要作用的CYP1A2(Furafylline)、CYP3A4(Ketoconazole)、CYP2C19(Ticlopidine)、CYP2D6(Quinidin)、CYP2E(4-Methlpyrazole)五种CYP450亚酶和黄素单氧化酶(FMO,Methimazole)为研究对象,本研究发现,GA的代谢主要由CYP3A参与,对M1,M2,M3,M4和M6的生成均有明显影响,代谢产物的抑制与Ketoconazole呈剂量依赖性,比现有文献报道的CYP3A1/2只参与了GA的C-22α羟化代谢,有更深入的发现,同时,首次观察到FMO参与了GA的部分羟化代谢(M1,M2,M3),而CYP1A2、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1对GA的代谢没有影响;在大鼠肝微粒体CYP450孵育体系中以各拆方组作为底物进行孵育,考察对GA代谢的影响,发现GLY增加了GA的转化,同时,羟化产物M1,M2,M3的生成量减少,未知代谢产物M6的生成量增加,而GLY,MET与GA共同孵育时对GA的转化和羟化代谢物的生成影响不大;在大鼠肝微粒体II相酶(UGT)孵育体系中以各拆方组作为底物进行孵育,考察对GA代谢的影响,各拆方组均发现GA的剩余量以及GAMG和GL的生成量增加的现象,其中,GLY,MET与GA共同孵育时可使GA的剩余量增加约90%,即活性产物量的增加,推测对GA有一定的增效作用,GAMG和GL的生成量增加约30%,对代谢产物的排泄可能有促进作用。本文进行了复方甘草酸苷片工业化生产的处方工艺优化和质量标准修订,完成了试生产及其质量评价,完成了人体生物等效性评价,采用UPLC/MS法,在Sprague-Dawley大鼠肝微粒体孵育液中系统的研究了GL,GA的体外代谢过程,通过拆方试验研究了复方甘草酸苷片中GLY和MET对GA代谢的影响,为GL类制剂的临床安全用药评价、进一步进行体内代谢研究奠定了实验基础,并为其他复方制剂的代谢研究提供了思路和方法。