目的:1、体内、外研究TLR4、RIAM是否参与糖脂毒性介导的骨代谢损害;2、探讨TLR4表达水平对糖脂毒性成骨细胞分化及RIAM水平的影响;3、分析TLR4是否通过调控RIAM-NF-κB核转位介导糖脂毒性成骨细胞分化障碍。方法:1、选用SPF级SD大鼠及构建TLR4基因敲除大鼠,通过高糖高脂饮食诱导,联合小剂量STZ造模T2DM,并继续高糖高脂干预16w后,动物水平观察T2DM及TLR4敲除对大鼠骨密度及RIAM表达的影响。2、采用成骨细胞前体MC3T3-E1细胞系,高糖（25m M）高脂（100μM）诱导分化14天构建慢性糖脂毒性模型,从细胞水平观察糖脂毒性对成骨细胞分化及TLR4、RIAM表达的影响。3、应用慢病毒载体转染MC3T3-E1细胞,分别敲低或过表达TLR4基因,再予高糖高脂干预,探讨调控TLR4对糖脂毒性成骨细胞分化及RIAM水平的影响。4、制备稳定转染的RIAM基因敲低及过表达MC3T3-E1细胞株,分别进行高糖高脂处理,再进一步予以TLR4激动剂或抑制剂干预,探究调控RIAM对糖脂毒性成骨分化的影响及其与代谢性炎症的关系;同时,通过激动或抑制NF-κB,以及免疫共沉淀技术探究NF-κB与RIAM是否存在相互调控以及相互作用。5、相关实验技术:双能X线吸收测量法测定骨密度,Western Blot检测TLR4、RIAM、NF-κB、RUNX2蛋白的表达,ELISA检测ALP、OCN等分泌型蛋白,RT-PCR检测RUNX2、ALP、OCN等成骨分化指标m RNA表达,免疫荧光技术观察RIAM蛋白在不同处理条件下的细胞内定位,免疫共沉淀（CO-IP）验证NF-κB与RIAM是否存在相互作用。结果:1、动物实验结果显示:与正常SD大鼠相比,T2DM大鼠骨组织TLR4、RIAM及NF-κB表达明显增加,BMD减低（全身、骨盆、脊柱、躯干、头骨,P<0.05）;与T2DM的SD大鼠比较,TLR4基因敲除的T2DM大鼠TLR4、RIAM及NF-κB表达均下调,全身、骨盆、脊柱、躯干、头骨的BMD增加,差异有统计学意义（P<0.05）。2、体外细胞实验结果显示:高糖高脂干预导致MC3T3-E1细胞RIAM与NF-κB发生核转位,TLR4、核内RIAM及核内NF-κB蛋白水平均增加,但基质钙化小结较少,RUNX2、ALP、OCN等成骨分化指标的m RNA及蛋白表达均明显降低（P<0.05）,抑制了MC3T3-E1细胞的成骨能力。3、Western Blot、ELISA及RT-PCR结果显示,与高糖高脂组比较,TLR4敲低+高糖高脂组中成骨细胞的核内RIAM、核内NF-κB水平下调,RUNX2、ALP、OCN表达增加（P<0.05）,改善了高糖高脂诱导的成骨细胞分化障碍;反之,TLR4过表达则上调核内RIAM及NF-κB水平,增强糖脂毒性对成骨分化的抑制作用。4、在高糖高脂干预下,RIAM与NF-κB相互作用增加,核转位明显;下调RIAM表达可减少NF-κB活化,促进成骨分化:与高糖高脂组比较,RIAM敲低+高糖高脂组的成骨细胞核内NF-κB水平降低,RUNX2、ALP、OCN的m RNA及蛋白表达增加（P<0.05）;同时,RIAM敲低亦可改善TLR4活化介导的成骨分化障碍:与TLR4激动剂组比较,RIAM敲低+TLR4激动剂组中成骨细胞核内NF-κB水平降低,而RUNX2、ALP及OCN蛋白表达上调（P<0.05）;反之,诱导RIAM高表达则可增加NF-κB入核,促进了糖脂毒性诱导的成骨细胞损害,减弱TLR4抑制对糖脂毒性成骨分化障碍的改善作用。结论:TLR4可通过调控RIAM活性介导糖脂毒性诱导的成骨分化障碍,这可能与调节RIAM与NF-κB相互作用,并促进NF-κB核转位活化有关。