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在本研究中，我们着重探讨了WSKY对精神分裂症大鼠模型中与海马相关的长时程空间记忆障碍的影响，结果表明，WSKY可促进分裂症模型大鼠长时程记忆的形成，量效关系呈倒“U”形。同时，为了深入研究WSKY对分裂症长时程记忆作用的分子机制，我们探讨了WSKY对海马神经元中与长时程记忆相关蛋白表达的影响:一、脑源性神经营养因子(BDNF)，作为神经营养因子家族中的重要一员，BDNF在大脑中分布广泛，对神经元的生长、发育、分化其着重要作用，BDNF与其高亲和力受体TrKB结合，能显著促进海马神经元LTP，通过影响活性依赖的突触可塑性，在学习和记忆功能的形成和维持中起着举足轻重的作用。二、cAMP反应原件结合蛋白(CREB)，作为重要的转录调节因子，CREB的功能表现在生命活动的许多方面，其中与学习记忆分子神经机制相关的功能尤为引人注意，早期研究表明，抑制CREB可以阻断果蝇长时程记忆的形成，反之，促进CREB的表达，则可促进长时程记忆的形成。CREB对长时程记忆的影响与其调节转录的作用密切相关，磷酸化后的CREB可增强多种靶基因的表达，形成新的突触联系，为长时程记忆的形成提供结构基础。同时，在小鼠中观察到，海马区长时程记忆增强是转录依赖性的，可见，CREB作为共价修饰短期过程到转录依赖的长期过程的枢纽，对长时程记忆的形成具有举足轻重的作用。
在本研究中，WSKY促进了海马神经元BDNF的表达，并上调了CREB的磷酸化，在学习记忆的分子机制中，神经活动导致钙离子内流增加，进而激活胞内的信号转导，MAPK/ERK、CaMIV和PKA等均可激活CREB，而BDNF与其高亲和力受体TrkB结合后，主要通过激活ERK/CREB途径来完成对记忆的促进作用，有研究证明BDNF/ERK/CREB在海马长时程空间记忆的形成具有重要意义。
第一部分 WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆及海马区BDNF表达的影响
目的:
1、利用HPLC对WSKY进行初步的有效成分分析和鉴定。
2、建立精神分裂症大鼠模型。
3、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆能力的影响。
4、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠海马区BDNF表达的影响。
方法:
按照前期实验中优化的制作工艺和质量控制方案制作WSKY，并利用HPLC初步分析和鉴定WSKY主要有效成分;将60只体重100±5的未成年雄性SD大鼠随机分为6组:模型组以MK-801（0.05mg/kg）连续腹腔注射14天（1次/天），利用旷场实验、强迫游泳试验以及Morris水迷宫检测检验模型;对照组予以等量生理盐水;WSKY处理组在腹腔注射MK-801前2h给予WS KY口服，分为:WSKY25+MK-801组，WSKY100+MK-801组，WSKY250+MK-801组和WSKY500+MK-801组(mg/kg，W/W)，口服给药14天。在9-14天，利用Morris水迷宫实验测查WSKY对大鼠长时程记忆的影响，记录指标包括定位航行实验中的逃逸时间和游泳速度，以及巡航试验中穿越原平台位置的次数和在目标象限停留时间;在行为学结束后，以免疫组织化学法检测WSKY对大鼠海马中BDNF表达的影响。
结果:
1、HPLC分析和鉴定:经过工艺改良和质量控制，WSKY的稳定性符合后期实验的要求，其主要成分包括:淫羊藿苷、党参炔苷、黄芪总皂苷、桂皮醛、橙皮苷、乌头碱等物质。
2、旷场实验结果:末次MK-801腹腔注射30分钟后，模型组和对照组在旷场实验中自发活动总路程无显著性差异(P＞0.05)，模型组与正常对照组无显著性差异(P＞0.05)。
3、强迫游泳试验结果:末次MK-801腹腔注射30分钟后，和对照组相比，模型组不动时间显著延长(P＜0.05)。
4、Morris水迷宫检测结果:(1) MK-801腹腔注射2周后，模型组和对照相比，两组大鼠游泳速度无显著性差异(P＞0.05)，定位航行实验期间模型组逃逸时间较对照组明显延长(F1,23=502.759，P＜0.001)，随着训练次数增加，模型组的逃逸时间亦可以逐渐缩短(F4,115=37.14，P＜0.01)。(2)定位航行期间，处理组与对照组及模型组相比，游泳速度均无明显差异(P＞0.05);WSKY25+MK-801，WSKY100+MK-801，WSKY250+MK-801三组训练期逃逸时间较模型组显著缩短(WSKY25+MK-801组，F1,27=10.248, P＜0.05; WSKY100+MK-801组，F1,27=206.159,P＜0.01;WSKY+MK-801组，F1,27=273.908，P＜0.01，分别和模型组相比)，而WSKY500+MK-801处理组，逃逸时间与模型组无明显差异。(3)巡航试验中，和模型组相比，WSKY100+MK-801组和WS KY250+MK-801组在目标象限停留时间显著延长(WSKY100+MK-801组:29.1±4.9vs.模型组:21.5±2.5，p=0.039，p＜0.05;WSKY250+MK-801组:32.31±3.65vs.模型组:21.5±2.5，p=0.002，p＜0.01)，而仅有WSKY250+MK-801组穿越平台区域的次数增加(WSKY250+MK-801:2.33±0.58vs.模型组:0.67±0.58，p＜0.01)。
5、免疫组化:与对照组相比，模型组海马CA1区(p＜0.01)及DG(p＜0.01)BDNF表达明显下降;和模型组相比，WSKY250+MK-801组DG区BDNF表达量显著增加(p＜0.01)，而CA1区有上升趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。
结论:
1、WSKY的稳定性符合后期实验的要求，主要成分分析为后期实验药理机制的探究提供基础。
2、利用低剂量MK-801(0.05mg/Kg)连续腹腔注射14天使大鼠自主活动未见明显增加，阴性症状明显，运动功能未受损，而长时程空间记忆明显受损，说明该谷氨酸能低下的精神分裂症认知损害模型有效。
3、经不同剂量WSKY处理后，大鼠运动功能未受影响，部分剂量组模型大鼠长时程记忆改善，量效关系呈倒“U”形。
4、促进海马DG区中神经元BDNF的表达，是WSKY改善长时程记忆的可能的分子机制之一。
第二部分 WSKY对海马神经元BDNF及其信号转导途径的影响
目的:
1、利用WSKY含药血清处理大鼠海马神经元，探讨WSKY对海马神经元中BDNF/ERK/CREB信号通路的影响。
2、观察WSKY对正常未成年大鼠海马区BDNF/ERK/CREB信号转导途径的影响。
方法:
体外部分:(1)取16-18天的SD胎鼠海马，进行海马神经元的培养、纯化和鉴定。(2)以WSKY250mg/Kg口服给药未成年大鼠，2次/日，5次给药后1h，麻醉后腹主动脉取血，静置，离心取血清，灭活，过滤除菌后，-80℃冻存备用。(3)实验分组:5％空白血清组、10％空白血清组、15％空白血清组，5％含药血清组、10％含药血清组、15％含药血清组，空白对照组（无血清培养）。(4) WesternBlotting法检测海马神经元proBDNF、BDNF、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB的蛋白表达变化，并分析PKA抑制剂H-89以及MEK抑制剂U-0126处理细胞后，ERK及CREB的活性及表达的情况。
体内部分:(1)18只未成年健康SD大鼠随机分为WSKY处理组（分别予以WSKY100mg/kg、250mg/kg）和对照组（予以等量生理盐水）口服给药2周，1次/日，末次给药后2h取大鼠海马，WesternBlotting法检测海马区BDNF、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB等的表达变化。
结果:
体外试验结果:(1)和对照组相比，各血清组均明显增加了proBDNF(p＜0.01)和matureBDNF(p＜0.01)的表达;和各浓度空白血清组相比，WSKY含药血清组对proBDNF的表达无显著性差异(P＞0.05)，但对BDNF的表达有显著的促进作用(p＜0.01)。(2)与对照组相比，WSKY含药血清对ERK(P＞0.05)和CREB(P＞0.05)的表达无明显影响，但是WSKY含药血清处理与磷酸化ERK1/2(p＜0.01)和磷酸化CREB(p＜0.01)的表达增加具有显著性相关。且这种促进作用能够被MEK抑制剂U-0126的预处理所完全阻断(p＜0.01)，而PKA抑制剂H-89则无完全阻断作用(P＞0.05)。
体内实验结果:WSKY100组与WSKY250组大鼠海马区proBDNF表达明显增加(p＜0.01)，同时促进磷酸化ERK(p＜0.01)和磷酸化CREB(p＜0.01)表达水平的增加。
结论:
WSKY能促进海马神经元中BDNF的表达，WSKY对分裂症大鼠长时程记忆的改善作用，可能与促进BDNF的表达以及激活BDNF/ERK/CREB信号转导途径有关。
在本研究中，WSKY促进了海马神经元BDNF的表达，并上调了CREB的磷酸化，在学习记忆的分子机制中，神经活动导致钙离子内流增加，进而激活胞内的信号转导，MAPK/ERK、CaMIV和PKA等均可激活CREB，而BDNF与其高亲和力受体TrkB结合后，主要通过激活ERK/CREB途径来完成对记忆的促进作用，有研究证明BDNF/ERK/CREB在海马长时程空间记忆的形成具有重要意义。
第一部分 WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆及海马区BDNF表达的影响
目的:
1、利用HPLC对WSKY进行初步的有效成分分析和鉴定。
2、建立精神分裂症大鼠模型。
3、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠长时程记忆能力的影响。
4、观察WSKY对精神分裂症模型大鼠海马区BDNF表达的影响。
方法:
按照前期实验中优化的制作工艺和质量控制方案制作WSKY，并利用HPLC初步分析和鉴定WSKY主要有效成分;将60只体重100±5的未成年雄性SD大鼠随机分为6组:模型组以MK-801（0.05mg/kg）连续腹腔注射14天（1次/天），利用旷场实验、强迫游泳试验以及Morris水迷宫检测检验模型;对照组予以等量生理盐水;WSKY处理组在腹腔注射MK-801前2h给予WS KY口服，分为:WSKY25+MK-801组，WSKY100+MK-801组，WSKY250+MK-801组和WSKY500+MK-801组(mg/kg，W/W)，口服给药14天。在9-14天，利用Morris水迷宫实验测查WSKY对大鼠长时程记忆的影响，记录指标包括定位航行实验中的逃逸时间和游泳速度，以及巡航试验中穿越原平台位置的次数和在目标象限停留时间;在行为学结束后，以免疫组织化学法检测WSKY对大鼠海马中BDNF表达的影响。
结果:
1、HPLC分析和鉴定:经过工艺改良和质量控制，WSKY的稳定性符合后期实验的要求，其主要成分包括:淫羊藿苷、党参炔苷、黄芪总皂苷、桂皮醛、橙皮苷、乌头碱等物质。
2、旷场实验结果:末次MK-801腹腔注射30分钟后，模型组和对照组在旷场实验中自发活动总路程无显著性差异(P＞0.05)，模型组与正常对照组无显著性差异(P＞0.05)。
3、强迫游泳试验结果:末次MK-801腹腔注射30分钟后，和对照组相比，模型组不动时间显著延长(P＜0.05)。
4、Morris水迷宫检测结果:(1) MK-801腹腔注射2周后，模型组和对照相比，两组大鼠游泳速度无显著性差异(P＞0.05)，定位航行实验期间模型组逃逸时间较对照组明显延长(F1,23=502.759，P＜0.001)，随着训练次数增加，模型组的逃逸时间亦可以逐渐缩短(F4,115=37.14，P＜0.01)。(2)定位航行期间，处理组与对照组及模型组相比，游泳速度均无明显差异(P＞0.05);WSKY25+MK-801，WSKY100+MK-801，WSKY250+MK-801三组训练期逃逸时间较模型组显著缩短(WSKY25+MK-801组，F1,27=10.248, P＜0.05; WSKY100+MK-801组，F1,27=206.159,P＜0.01;WSKY+MK-801组，F1,27=273.908，P＜0.01，分别和模型组相比)，而WSKY500+MK-801处理组，逃逸时间与模型组无明显差异。(3)巡航试验中，和模型组相比，WSKY100+MK-801组和WS KY250+MK-801组在目标象限停留时间显著延长(WSKY100+MK-801组:29.1±4.9vs.模型组:21.5±2.5，p=0.039，p＜0.05;WSKY250+MK-801组:32.31±3.65vs.模型组:21.5±2.5，p=0.002，p＜0.01)，而仅有WSKY250+MK-801组穿越平台区域的次数增加(WSKY250+MK-801:2.33±0.58vs.模型组:0.67±0.58，p＜0.01)。
5、免疫组化:与对照组相比，模型组海马CA1区(p＜0.01)及DG(p＜0.01)BDNF表达明显下降;和模型组相比，WSKY250+MK-801组DG区BDNF表达量显著增加(p＜0.01)，而CA1区有上升趋势，但无显著性差异(P＞0.05)。
结论:
1、WSKY的稳定性符合后期实验的要求，主要成分分析为后期实验药理机制的探究提供基础。
2、利用低剂量MK-801(0.05mg/Kg)连续腹腔注射14天使大鼠自主活动未见明显增加，阴性症状明显，运动功能未受损，而长时程空间记忆明显受损，说明该谷氨酸能低下的精神分裂症认知损害模型有效。
3、经不同剂量WSKY处理后，大鼠运动功能未受影响，部分剂量组模型大鼠长时程记忆改善，量效关系呈倒“U”形。
4、促进海马DG区中神经元BDNF的表达，是WSKY改善长时程记忆的可能的分子机制之一。
第二部分 WSKY对海马神经元BDNF及其信号转导途径的影响
目的:
1、利用WSKY含药血清处理大鼠海马神经元，探讨WSKY对海马神经元中BDNF/ERK/CREB信号通路的影响。
2、观察WSKY对正常未成年大鼠海马区BDNF/ERK/CREB信号转导途径的影响。
方法:
体外部分:(1)取16-18天的SD胎鼠海马，进行海马神经元的培养、纯化和鉴定。(2)以WSKY250mg/Kg口服给药未成年大鼠，2次/日，5次给药后1h，麻醉后腹主动脉取血，静置，离心取血清，灭活，过滤除菌后，-80℃冻存备用。(3)实验分组:5％空白血清组、10％空白血清组、15％空白血清组，5％含药血清组、10％含药血清组、15％含药血清组，空白对照组（无血清培养）。(4) WesternBlotting法检测海马神经元proBDNF、BDNF、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB的蛋白表达变化，并分析PKA抑制剂H-89以及MEK抑制剂U-0126处理细胞后，ERK及CREB的活性及表达的情况。
体内部分:(1)18只未成年健康SD大鼠随机分为WSKY处理组（分别予以WSKY100mg/kg、250mg/kg）和对照组（予以等量生理盐水）口服给药2周，1次/日，末次给药后2h取大鼠海马，WesternBlotting法检测海马区BDNF、ERK1/2、pERK1/2、CREB、pCREB等的表达变化。
结果:
体外试验结果:(1)和对照组相比，各血清组均明显增加了proBDNF(p＜0.01)和matureBDNF(p＜0.01)的表达;和各浓度空白血清组相比，WSKY含药血清组对proBDNF的表达无显著性差异(P＞0.05)，但对BDNF的表达有显著的促进作用(p＜0.01)。(2)与对照组相比，WSKY含药血清对ERK(P＞0.05)和CREB(P＞0.05)的表达无明显影响，但是WSKY含药血清处理与磷酸化ERK1/2(p＜0.01)和磷酸化CREB(p＜0.01)的表达增加具有显著性相关。且这种促进作用能够被MEK抑制剂U-0126的预处理所完全阻断(p＜0.01)，而PKA抑制剂H-89则无完全阻断作用(P＞0.05)。
体内实验结果:WSKY100组与WSKY250组大鼠海马区proBDNF表达明显增加(p＜0.01)，同时促进磷酸化ERK(p＜0.01)和磷酸化CREB(p＜0.01)表达水平的增加。
结论:
WSKY能促进海马神经元中BDNF的表达，WSKY对分裂症大鼠长时程记忆的改善作用，可能与促进BDNF的表达以及激活BDNF/ERK/CREB信号转导途径有关。