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抗生素功能化磁性纳米微球（Magnetic nanoparticle,MNP）在分离富集细菌上有较好的应用前景。细菌检测包括活性和核酸检测两方面。可用于细菌活性检测的细菌分离富集材料,必须不影响细菌活性;用于细菌核酸检测,则需与核酸提取方法有机结合。在实际样品中,往往同时存在多种细菌,但目前对如何利用功能化MNP同时分离富集样品中不同细菌的研究较少。靶向革兰氏阳性（Gram positive,G+）菌的万古霉素（Vancomycin,Van）,和可有效结合革兰氏阴性（Gram negative,G-）菌的粘菌素是目前最常用于制备功能化纳米材料的抗生素。多粘菌素B（Polymyxin B,PMB）具有广谱细菌结合特性,对G-的结合能力更强,价格仅为粘菌素的10%,更适合用于制备功能化MNP,目前尚无PMB修饰MNP的报道。第一章抗生素功能化磁性纳米微球的制备及性能评价目的:制备系列抗生素功能化MNP,评价其结构特征、吸附特性和稳定性。方法:首先优化PMB功能化MNP的合成条件,在氨基化MNP(MNP-NH2)和未修饰基团的Fe3O4表面,依次修饰聚多巴胺（PDA）壳层、聚乙二醇（PEG）分子臂和PMB,得到MNPPDA-PEG-PMB和Fe3O4PDA-PEG-PMB;同时在MNP-NH2上依次连接PEG分子臂和PMB,制备MNPPEG-PMB。并根据文献,在羧基化MNP(MNP-COOH)表面,依次连接PEG分子臂和Van,得到MNPPEG-Van。透射电子显微镜（TEM）、动态光散射法（DLS）、红外光谱（FT-IR）和热重（TG）分析各功能化MNP的形貌、粒径和化学组成;扫描电子显微镜（SEM）观察MNP与细菌结合的形态。分析MNP对PBS中细菌的吸附容量、吸附动力学曲线和吸附特异性,并分析其抗干扰性能和稳定性。最后,评价MNP对实际样品中细菌的吸附率。结果:TEM显示MNPPDA-PEG-PMB、MNPPEG-PMB和MNPPEG-Van均呈单分散球形,Fe3O4PDA-PEG-PMB形状不均匀。DLS测得的MNPPDA-PEG-PMB、MNPPEG-PMB和MNPPEG-Van粒径分别为235.00±11.70,225.16±12.30和220.00±20.50 nm。FT-IR证实本实验成功制备了各功能化MNP,TGA计算得MNPPDA-PEG-PMB和MNPPEG-PMB表面PMB含量分别为119.43和42.54μmol/g,MNPPEG-Van表面Van含量为96.68μmol/g。SEM显示MNP均聚集在细菌表面。MNPPDA-PEG-PMB、MNPPEG-PMB对PBS中E.coli的最大吸附容量为2.00×10~9和1.90×10~8 CFU/mg,MNPPEG-Van对S.aureus的吸附容量为1.14×10~9 CFU/mg。各MNP均可在30 min时达到吸附平衡。在PBS中,MNPPDA-PEG-PMB和MNPPEG-PMB可吸附G-和G+,MNPPEG-Van仅能吸附G+。在含不同浓度LB的PBS中,各MNP的吸附率与在PBS中没有显著性差异（p＞0.05）。MNPPDA-PEG-PMB和MNPPEG-Van具有良好的热稳定性和储存稳定性,可重复利用至少3次,而MNPPEG-PMB不适合重复利用。在10~2 CFU/m L细菌加标的各样品中,MNPPDA-PEG-PMB能高效富集E.coli和PBS、自来水、尿液中的S.aureus;MNPPEG-PMB仅可富集各样品中的E.coli和PBS中的S.aureus;MNPPEG-Van仅能富集各样品中的S.aureus;混合微球MNPPDA-PEG-PMB+MNPPEG-Van能有效富集各样品中的E.coli和S.aureus;MNPPEG-PMB+MNPPEG-Van能富集E.coli,对S.aureus的吸附率为72%-78%,显著低于MNPPDA-PEG-PMB+MNPPEG-Van（p＜0.05）。结论:MNPPDA-PEG-PMB的吸附容量显著高于MNPPEG-PMB,显示在MNP-NH2表面修饰PDA后,有助于提高MNPPDA-PEG-PMB的吸附容量。MNPPDA-PEG-PMB可有效吸附PBS和部分环境和生物样品中G-和G+;但MNPPEG-PMB仅可有效吸附PBS中G-和G+,和各样品中的G-;MNPPEG-Van仅可特异性吸附G+;混合微球可有效富集不同样品中的G-和G+。第二章抗生素功能化磁性纳米微球在细菌快速检测中的应用目的:分析功能化MNP在细菌核酸和细菌活性快速检测中的应用,以及联合使用多种抗生素功能化MNP,实现对同一样品中多种细菌的富集和快速检测。方法:各功能化MNP富集PBS中不同浓度细菌后,热裂法提取核酸后,首先评价q PCR检测粗提核酸的灵敏度（富集倍数=10）;然后,q PCR和CRISPR-Cas13检测粗提核酸（富集倍数100）,分析单一和混合使用的功能化MNP快速鉴定不同样品中单一细菌的性能;并进一步利用q PCR和CRISPR-Cas13鉴定20 m L牛奶中的混合细菌（1:1,浓度比,富集倍数200）。最后,采用生长曲线法和培养法分析功能化MNP在细菌活性快速检测中的应用。结果:MNP富集PBS中的细菌后（富集倍数=10）,q PCR的最低检出限为10~2CFU/m L。MNP富集加标的实际样品后（富集倍数=100）,进行q PCR或CRISPR-Cas13检测,MNPPDA-PEG-PMB组可检测各样品中的E.coli（回收率103.30%-107.56%）和自来水、尿液中的S.aureus（111.52%-114.59%）;MNPPEG-PMB组仅能检测E.coli（91.58%-104.13%）;MNPPEG-Van组仅能检测S.aureus（98.26%-104.68%）;MNPPDA-PEG-PMB+MNPPEG-Van和MNPPEG-PMB+MNPPEG-Van组能检测E.coli（94.57%-107.53%）和S.aureus（93.07%-109.52%）。未经分离富集直接热裂法提取核酸的样品,q PCR均无法鉴定,但Cas13均可检测。MNP富集大体积牛奶中混合细菌后（富集倍数=200）,如q PCR检测,MNPPDA-PEG-PMB组仅可鉴定E.coli（106.07%-112.21%）,MNPPEG-Van组仅可鉴定S.aureus（123.45%-124.62%）,MNPPDA-PEG-PMB+MNPPEG-Van组可同时鉴定E.coli（108.66%-119.66%）和S.aureus（123.45%-124.84%）,最低检出限均为50 CFU/m L。如采用CRISPR-Cas13检测,最低检出限为5 CFU/m L,未经分离富集直接热裂法提取核酸的牛奶样品,q PCR和Cas13均无法检测。在细菌活性检测中,各MNP与细菌结合后不影响其活性,可直接加入固体或液体培养基培养。结论:单一MNP富集后结合热裂法,能快速鉴定各样品中的某一类细菌,混合使用MNPPDA-PEG-PMB+MNPPEG-Van可同时鉴定G-和G+。通过提高样本量提高富集倍数,可提高q PCR和CRISPR-Cas13鉴定细菌的灵敏度。功能化MNP结合细菌后,对细菌活性无显著影响,可快速检测细菌活性。