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本研究通过将小鼠第二次减数分裂中期(MII)卵子的纺锤体移植到另一枚卵子中,孤雌激活后排出两个极体；体外发育得到囊胚,进而从中分离出胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs),并进行了形态学观察、核型分析、碱性磷酸酶染色、OCT-4染色、SSEA-1染色和类胚体形成等一系列的检测。为了探究此ES细胞的体内分化潜能,通过囊胚注射ES细胞的方法制备了嵌合小鼠,流式细胞分析嵌合体小鼠心脏,脾脏,肾脏和骨髓中的嵌合程度,将所得到的嵌合体小鼠与昆明小鼠进行交配以检验该细胞系是否具有生殖系转化能力。
1.核移植重构胚构建及体外发育在构建纺锤体移植的重构胚过程中,共使用转EGFP基因小鼠体内成熟MII卵母细胞160枚作为纺锤体供体卵子,纺锤体受体卵子为昆明小鼠体内成熟MII卵子,核移植成功操作114枚(71.25％)。将此移入转EGFP基因小鼠纺锤体的卵子进行电融合处理,共有103枚(90.35％)卵子融合。再将成功融合的卵子进行SrCl2激活,6小时后,有69枚重构卵子(66.99％)形成2个原核并排出两个极体。将这已激活的重构胚在KSOM发育培养液中体外发育培养,共得到12枚囊胚,囊胚发育率为17.39％。
2.胚胎干细胞分离及鉴定所有12枚囊胚种植到经丝裂霉素处理的小鼠胎儿成纤维细胞饲养层上。
5-6d后,形成7个鸟巢状结构,其中3个内细胞团生长良好,从这3个鸟巢状结构中分离得到3株孤雌胚胎干细胞系。形态观察:ES细胞呈克隆状生长,细胞紧密地聚集在一起,形似鸟巢,内部细胞界限不清,核大,胞浆少。荧光显微镜观察显示ES细胞克隆发出很强的绿色荧光。
核型分析:ES细胞具有正常二倍体核型,共40条染色体。
碱性磷酸酶(AKP)染色:ES细胞克隆被染成深蓝色,说明细胞显示碱性磷酸酶活性。
SSEA-1染色和OCT-4染色：呈阳性。
类胚体:EGFP标记的ES细胞在体外分化形成类胚体表明具有很好的分化潜能,形成的类胚体在荧光显微镜下发出很强的绿色荧光。
3.杂合孤雌胚胎干细胞(Hvbrid parthenogenetic stem cells,HP-ES)体内分化研究收集昆明小鼠的囊胚作为受体胚胎,制备ES细胞的单细胞悬液作为供体细胞,然后进行ES细胞囊胚腔注射,每个囊胚腔内注入10～15个ES细胞。继续培养1h后,共移植到假孕受体中175枚,使用假孕受体11只,产仔共44只,其中毛色嵌合小鼠6只。生殖系嵌合能力检测：将此6只嵌合体小鼠与昆明小鼠交配,其中1只嵌合体的后代中出现黑毛色小鼠,说明此嵌合体的生殖系中有来源于ES细胞的配子。流式细胞分析：分别将3只嵌合小鼠的心、脾、肾、骨髓消化成为单细胞悬液,进行流式细胞检测,结果显示HP-ES细胞在心、脾、肾和骨髓中的嵌合率分别是27.88％、12.48％、1.8％和6.93％。