基于RhoA/Rock信号通路研究隔药饼灸调控细胞自噬稳定AS兔易损斑块的作用机制

来源 :湖南中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:lgyangell
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目的:1.探讨隔药饼灸对AS易损斑块兔Rho A/Rock信号通路的作用机制;2.观察隔药饼灸对Rho A/Rock信号通路相关蛋白表达及细胞自噬功能的影响,探讨隔药饼灸稳定AS易损斑块的作用机理。方法:取健康雄性新西兰大耳白兔70只,体重1.8~2.2kg。适应性喂养1周后随机抽取10只作为空白组对照组,给与普通饲料喂养。其余60只作为手术组,给与高脂饲料喂养,高脂饲养2周后对手术组兔行腹主动脉球囊损伤术,术后死亡动物5只,将存活的55只手术组兔随机分为模型组(11只)、直接灸组(11只)、隔药饼灸组(11只)、Rho激酶抑制剂组(11只)、西药组(11只)。术后手术组兔以高脂饲料继续喂养8周并同时给予相应的干预手段进行干预,共治疗8周。治疗结束后,停止高脂喂养,所有动物给与普通饲料喂养,并于治疗结束后的第一天对除空白组外的所有动物运用Ad5-p53重组载体(今又生)进行基因转染,基因转染共2周。于第13周末(取材前24小时和48小时)对除空白组外的所有动物给予中国斑点蝰蛇毒(CRVV)和组胺行药物触发2次。运用Elisa检测血清血脂6项:总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、载脂蛋白A、B(apo-A、apo-B);运用透射电镜观察腹主动脉超微结构及自噬体;运用HE染色技术测量血管内膜、内膜中膜厚度(IMT);运用Western Blot检测技术,检测腹主动脉Rho A、Rock1、Beclin1、LC3Ⅱ的蛋白表达及LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的变化。结果:1.血脂:与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组、西药组TG、TC、LDL含量均显著降低(p<0.01,p<0.05),HDL含量及HDL/LDL比值显著升高(p<0.01,p<0.05)。与直接灸组比较,隔药饼灸组与西药组各血脂水平无显著变化(P>0.05)。与隔药饼灸组比较,西药组各血脂水平均无显著变化(P>0.05)。结果表明三个治疗组在调节AS易损斑块兔整体血脂水平方面均具有显著疗效,且疗效相当,无显著差异。说明隔药饼灸可有效调节血脂水平达到抗AS稳斑作用。2.载脂蛋白:与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组、西药组APO-A含量显著升高(p<0.05),APO-B含量及APO-B/APO-A比值显著降低(p<0.05,p<0.01)。与直接灸组比较,隔药饼灸组APO-B含量显著降低(p<0.01),APOA、APO-B/APO-A比值含量无显著变化(p>0.05);西药组各指标水平均无显著变化(p>0.05)。与隔药饼灸组比较,西药组APO-B含量显著升高(p<0.05),APO-A含量、APO-B/APO-A比值无显著变化(p>0.05)。结果表明三个治疗组改善AS易损斑块兔载脂蛋白作用显著,且在调节APO-B含量方面,隔药饼灸组疗效最显著,在调节APO-A含量方面,三个治疗组均疗相当,组间无显著差异。3.HE染色观察血管内膜变化:与空白组比较,模型组血管内膜增厚,向管腔内突起,形成斑块,可见血栓形成,中膜结构破坏,弹力纤维排列不规则,结构欠清晰,平滑肌细胞胞质疏松,可见大量泡沫细胞,斑块内可见多处出血。与模型组比较,直接灸组血管损伤程度与模型组相当,隔药饼灸组、西药组中膜损伤程度较模型组稍减轻。三个治疗组未见血栓形成,内膜、内膜-中膜厚度均较模型组显著减少(p<0.05,p<0.01),三个治疗组间内膜、内膜-中膜厚度无显著差异,斑块稳定性较模型组增加。说明隔药饼灸治疗可减少血管内膜、内膜-中膜的增生程度,且未见管腔内血栓形成及斑块内出血,达到稳定AS易损斑块的作用。4.超微透射电镜观察板块内超微结构:与空白组比较,模型组血管平滑肌细胞转化成泡沫细胞,泡沫池中大量脂滴分布,大量胶原纤维丝断裂溶解呈絮状,细胞膜、细胞器损坏严重,未见自噬体存在;与模型组比较,直接灸组、隔药饼灸组细胞器损坏严重程度相当,但可见自噬体存在,说明细胞自噬功能增强。西药组细胞损坏程度最轻,部分细胞器及胶原纤维保留,但视野中未见自噬体存在。说明隔药饼灸对AS易损斑块兔细胞自噬功能具有促进作用。5.WB检测Rho A、Rock1、Beclin1、LC3B蛋白表达(1)Rho A/Rock蛋白表达:与空白组比较,模型组Rho A、Rock1蛋白表达显著升高。与模型组比较,抑制剂组兔腹主动脉Rho A、Rock1蛋白表达受到抑制,差异具有统计学意义(p<0.05);直接灸组Rho A、Rock1蛋白表达无显著差异(p>0.05);隔药饼灸组Rho A、Rock1蛋白表达显著降低(p<0.05,p<0.01);西药组Rho A蛋白表达显著降低(p<0.05),Rock1蛋白表达无显著变化(p>0.05);与直接灸组比较,隔药饼灸组Rho A、Rock1蛋白表达显著降低(p<0.05);西药组西药组Rho A蛋白表达显著降低(p<0.05),Rock1蛋白表达无显著变化(p>0.05)。说明隔药饼灸与西药干预后可抑制Rho A、Rock1蛋白表达,且二者疗效相当。(2)自噬相关蛋白表达:与空白组比较:模型组Beclin1蛋白表达显著升高(p<0.01),LC3Ⅱ、LC3Ⅱ/Ⅰ比值也有升高趋势,但差异不显著(p>0.05)。与模型组比较:直接灸组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达显著升高(p<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ比值无显著变化(p>0.05);隔药饼灸Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(p<0.01,p<0.05);西药组Beclin1无显著变化(p>0.05),LC3Ⅱ蛋白表达与LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(p<0.01);抑制剂组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值显著升高(p<0.01)。与直接灸组比较:隔药饼灸组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均无显著变化(p>0.05);西药组Beclin1蛋白表达显著降低(p<0.01),LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均无显著变化(p>0.05)。与隔药饼灸组比较:西药组Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均无显著差异(p>0.05);抑制剂组Beclin1蛋白表达显著升高(p<0.01),LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均无显著差异(p>0.05)。与西药组比较:抑制剂组Beclin1蛋白表达显著升高(p<0.01),LC3Ⅱ蛋白表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比值均无显著差异(p>0.05)。说明经隔药饼灸干预后,细胞的自噬水平升高。结论:1、隔药饼灸对AS易损斑块兔血脂、载脂蛋白代谢具有良好的调节作用。2、隔药饼灸可改善AS易损斑块兔血管内膜结构,抑制内膜增生,从而稳定动脉粥样斑块。3、隔药饼灸可抑制Rho A/Rock信号通路,进一步促进细胞自噬功能,起到稳定AS易损斑块的作用。
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