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第一部分CCL20和MDSCs在急性心肌炎患者外周血中的表达及其相关性研究目的:检测急性心肌炎患者外周血中趋化因子CCL20的表达水平以及MDSCs、CCR6+MDSCs的细胞比例,并初步探讨MDSCs与CCL20之间的关系以及CCR6+MDSCs与CCL20之间的关系。方法:纳入2017年12月-2018年10月在武汉协和医院就诊的急性心肌炎患者以及门诊体检的健康人群各20例为研究对象。在入院第一天采集静脉血,用酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测健康对照组和急性心肌炎患者组外周血中CCL20的浓度;用流式细胞术分析两组外周血中CD14+HLA-DR-/lowMDSCs以及CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例;用Pearson相关分析法对急性心肌炎患者血浆中CCL20与CD14+HLA-DR-/lowMDSCs、CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例之间的关系进行分析。结果:急性心肌炎患者组外周血中CCL20的浓度为(10.78±2.57)pg/ml,健康对照组CCL20的浓度为(2.90±0.56)pg/ml,两组差异有统计学意义(p<0.001);同时,与健康对照组相比,急性心肌炎患者外周血中CD14+HLA-DR-/low/low MDSCs以及CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例均显著升高(P<0.001);Pearson相关性分析示急性心肌炎患者外周血CD14+HLA-DR-/low/low MDSCs的细胞比例与CCL20水平均呈正相关(R=0.6129,P<0.01);急性心肌炎患者外周血中CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例也与CCL20水平呈正相关(R=0.7447,P<0.001)。结论:急性心肌炎患者血浆中CCL20的表达水平、CD14+HLA-DR-/lowMDSCs以及CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例均较健康对照组明显升高。急性心肌炎患者外周血CD14+HLA-DR-/lowMDSCs以及CCR6+CD14+HLA-DR-/lowMDSCs的细胞比例与CCL20的表达水平均具有一定的相关性。第二部分CCL20在实验性自身免疫性心肌炎小鼠中对CCR6+MDSCs迁移过程的影响目的:观察实验性自身免疫性心肌炎小鼠在不同时间点骨髓、脾脏、外周血以及心脏组织中CCR6+MDSCs比例的动态变化,并探讨CCL20与CCR6+MDSCs之间的关系。方法:选取96只18-20g雄性Balb/c小鼠,随机分为4组:control组(n=36只)、EAM组(n=36只)、EAM+同型对照组(n=12只)、EAM+CCL20 m Ab组(n=12只)。1.分别在实验第7天、10天、14天、21天从control组和EAM组中随机选取6只小鼠,用流式细胞术分析两组小鼠骨髓、脾脏、外周血以及心脏中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例变化情况;用RT-PCR法检测control组和EAM组小鼠心脏组织中CCR6和CCL20的m RNA表达水平;2.在实验第21天将4组(control组、EAM组、EAM+同型对照组、EAM+CCL20m Ab组)剩余48只小鼠全部处死,测量各组小鼠的体重以及心脏的重量,并计算心脏重量/体重比;通过HE/Masson染色观察4组小鼠心肌组织的病理改变;3.通过酶联免疫吸附实验法(ELISA)检测4组小鼠外周血中CCL20的浓度;4.利用免疫荧光技术(IF)检测CCL20与成纤维细胞标志-Vimentin在心肌组织中的共定位表达;5.采用流式细胞术分析4组小鼠心脏、脾脏中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例变化情况;6.用RT-PCR法检测4组小鼠心脏中细胞因子IL-4、IL-6、IL-10 m RNA水平。结果:1.与control组相比,EAM小鼠骨髓中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例在D10天达到峰值(p<0.001),随后开始下降;脾脏中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例在D10天轻微升高,并在D14天开始下降(p<0.05);而外周血和心脏中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例在D14、D21天均比control组增多(p<0.001),且在D21天达到峰值;在D21天,EAM组小鼠心脏组织中CCL20以及CCR6的m RNA表达水平均比control组明显上调(p<0.05);2.EAM组和EAM+同型对照组的心肌炎临床评分、HW/BW(心脏/体重比)均明显高于control组(p<0.01),且EAM+CCL20m Ab组均比EAM组和EAM+同型对照组明显减少(p<0.01);3.与control组相比,EAM组和EAM+同型对照组CCL20水平明显升高(p<0.05),而EAM+CCL20m Ab组比其他EAM组和EAM+同型对照组显著减少(p<0.01);4.免疫荧光染色显示,CCL20在EAM组和EAM+同型对照组小鼠心脏成纤维细胞上有广泛表达,而EAM+CCL20m Ab组心脏组织中CCL20的表达明显减少;5.与control组相比,EAM组和EAM+同型对照组小鼠脾脏中的CCR6+CD11b+G-1+MDSCs明显减少(p<0.01),而EAM+CCL20m Ab组细胞比例均比EAM组和EAM+同型对照组均显著增多(p<0.05);EAM组和EAM+同型对照组小鼠心脏中CCR6+CD11b+G-1+MDSCs的细胞比例均比control组明显增多(p<0.05),而EAM+CCL20m Ab组细胞比例比EAM组和EAM+同型对照组均显著减少(p<0.05);6.RT-PCR结果示,EAM组和EAM+同型对照组IL-4、IL-6、IL-10的m RNA表达水平均较control组显著上调(p<0.05);与EAM组和EAM+同型对照组相比,CCL20m Ab组心脏组织中IL-6 m RNA表达明显下调(p<0.01),IL-10和IL-4 m RNA的表达水平均明显升高(p<0.05)。结论:1.在自身免疫性心肌炎小鼠中,骨髓可产生CCR6+MDSCs,在CCL20的作用下迁移至心脏炎症部位;2.自身免疫性心肌炎小鼠心脏成纤维细胞表达趋化因子CCL20,阻断CCL20可显著减少CCR6+MDSCs在心脏部位的募集,减轻EAM小鼠心肌炎症表现。