目的：由于颅脑手术等多种因素,细菌、病毒等病原体会进入脑脊液循环,从而引发中枢神经系统感染。国内外研究表明主要是葡萄球菌属Staphylococcus(革兰氏阳性菌)以及不动杆菌属Acinetobacter(革兰氏阴性菌)这两大类细菌引起中枢神经系统感染,其诊断主要依靠临床病原学的检测。脑膜炎是由于中枢神经系统感染而导致的疾病中最为常见的表现形式,其按病因可以分为病毒性、细菌性以及结核性脑膜炎,其中细菌性脑膜炎最为多见,细菌多在上呼吸道感染时通过鼻腔进入颅内,引起发热、头痛和典型的喷射样呕吐。脑脊液病原菌培养检测是中枢神经系统感染诊断的确诊依据和金标准。脑脊液样本首先经培养,报阳标本将继续通过革兰染色、显微镜检和生化试验对病原菌进行鉴定。该方法完成鉴定需几天的时间,耗时长,通常临床治疗中为快速控制感染在得到鉴定结果前已进行广谱抗生素的治疗,这种治疗有可能提高耐药菌产生的几率。另外,仅仅依据微生物的生物学特征进行分类,往往无法反映其遗传学特征,以及菌种间进化上的关系。使用分子生物学方法进行菌种鉴定,可以有效识别突变菌种,并从遗传水平理解菌株的耐药性,进而实现抗生素治疗的优化,减少耐药性发生。但传统的细菌鉴定方法耗时较长,中枢神经系统感染的治疗以抗生素的应用为主,临床治疗早期是经验性用药,待有病原学鉴定结果后再应用敏感抗生素。研究发现长期以来抗生素的使用使细菌耐药情况愈发严重,用药缺乏针对性或使用已发生细菌耐药的抗生素可能使病情得不到控制而恶化。因而,快速、准确的病原学鉴定方法对治疗疾病是很重要的。新的分子生物学方法相继出现并应用于微生物鉴定,如蛋白质谱、聚合酶链式反应PCR等。蛋白质谱可测定细菌本身独特的蛋白质组成,然后再利用质谱技术将测得的蛋白质和多肽按分子量大小排列，从而形成独特的蛋白质组指纹图,最后可以经由特征性模式峰来鉴定菌株。传统方法和新的分子生物学方法在病原菌检测方面各有优势,实际应用中根据实际情况合理选用可最大限度地发挥各检测手段的优势。除传统的生化鉴定方法外,蛋白质谱和16S rRNA PCR等鉴定方法相对快速,而且国内外研究发现蛋白质谱和PCR方法准确率较传统方法的鉴定率高。为进一步了解通常医院所见的引起脑部感染的一些病原菌的具体分布状况和感染脑内的病菌的耐药情况,同时了解各种鉴定方法之间的差异。本研究首先对我院2008年1月-2011年12月送检的240份感染性脑脊液样本培养结果进行回顾性分析,在VITEK2鉴定后对所占比例最大的凝固酶阴性葡萄球菌(CNS,coagulase-negative staphylococcus)分别利用蛋白质谱和16S rRNA基因PCR扩增的方法进行再次鉴定,同时对检测出的主要葡萄球菌序列在进行仔细的同源性比对分析之后绘制它们的系统进化树,以进一步了解其进化情况。最后,分别对占CNS比例最大的表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)和主要革兰氏阴性杆菌进行了抗生素耐药性分析,为指导临床用药提供依据。另外,本研究将报道一例罕见的由空肠弯曲杆菌中枢神经系统感染导致的急性运动性轴索型神经病。方法：1.感染性脑脊液菌株传统生化鉴定浑浊或脓性的脑脊液直接涂片后染色镜检。将无色透明的脑脊液以3000转／分钟离心10-15分钟,弃上清,收集下面的沉淀物进行涂片,然后做革兰染色镜检。根据染色反应及细菌形态特征,初步判断感染细菌的种类。对240份脑脊液标本进行分离培养,经革兰染色判定细菌类型后,通过API和VITEK2等生化检测方法鉴定细菌表型。2.蛋白质谱及16S rRNA PCR鉴定细菌表型VITEK MS是一种基质辅助激光解析电离飞行时间(Matrix-assisted laser desorption/Ionization time of flight, MALDI-TOF)技术,用于对微生物培养物进行分析,鉴定微生物种类。首先将待鉴定菌、校准菌和质控菌分别涂布在靶板的点位中,加入1微升VITEK MS-CHCA基质,待全部干燥后即放入VITEK MS仪器来获取这三种细菌的全细胞蛋白(尤其是核糖体蛋白)质谱。然后将待鉴定菌质谱与数据库中已知菌质谱进行比较、分析获得鉴定结果。采用煮沸裂解法制备模板DNA：无菌操作取血平板上培养过夜的新鲜单菌落6-8个,首先将其混悬于0.3毫升含有50U/毫升溶葡球菌素(Lysostaphin)的Tris-EDAT缓冲液(pH=8)中,然后35℃水浴处理30分钟,最后100℃煮沸10分钟,以15000转/分钟的转速离心20秒,收集上清液即为细菌总DNA溶液,在-20℃下冻存用于PCR扩增。3.CNS同源性分析将测序所得基因序列提交至GenBank来完成Blast比对,通过ClustalW完成多序列比对,运用MEGA4.0进行同源分析,采用邻接法(Neighbor-Joining)进行进化树分析,并采用自举检验(Bootstraping)法进行结果的可信度分析。利用系统进化分析软件对鉴定出的CNS进行序列比对分析后绘制系统进化树。4.表皮葡萄球菌抗生素耐药性分析采用E-TEST法进行；其它药敏试验如氨苄西林/舒巴坦、庆大霉素、克林霉素、青霉素、红霉素、磷霉素、头孢西丁、左旋氧氟沙星、头孢呋辛、头孢唑林、力奈唑烷、利福平和复方新诺明采用K-B法,药敏纸片为英国OXOid公司产品。质控菌株为表皮葡萄球菌ATCC12228,对不同抗生素的耐药性分析。5.G-杆菌抗生素耐药性分析脑部感染的鲍曼不动杆菌共27株,铜绿假单胞菌共12株,对不同抗生素的耐药率分析。6.空肠弯曲菌感染致急性运动性轴索型神经病一例报告结果：1.感染性脑脊液菌株传统生化鉴定显示：240份样本中,CNS检出率为30.4%(73例),鲍曼不动杆菌检出率为11.3%(27例)为,革兰阳性杆菌为9.6%(23例),微球菌为8.3%(20例),真菌为6.7%(16例),其它病原菌检出率都在6.3%以下。2.蛋白质谱及16S rRNA PCR鉴定细菌表型显示鉴定为CNS的菌株同样为73份：包括42株表皮葡萄球菌(占17.5%),8株人葡萄球菌(占3.3%)、6株沃氏葡萄球菌(占2.5%)、4株头状葡萄球菌(占1.7%)、2株松鼠葡萄球菌(占0.8%)、6株溶血葡萄球菌(占2.5%)2株腐生葡萄球菌(占0.8%)、2株木糖葡萄球菌(占0.8%)和1株路邓葡萄球菌(占0.4%),其中占脑部感染病原菌分布第1位为表皮葡萄球菌。对VITEK2与蛋白质谱鉴定结果不一致的菌株经16S rRNA鉴定后发现PCR鉴定结果与蛋白质谱鉴定结果相同,VITEK2鉴定符合率为97.3%。3.CNS同源性分析显示：溶血葡萄球菌、路邓葡萄球菌、人葡萄球菌、表皮葡萄球菌和木糖葡萄球菌在进化树上形成亲缘关系较近的一群,而松鼠葡萄球菌、腐生葡萄球菌、沃氏葡萄球菌和头状葡萄球菌在进化树上亲缘关系较近。4.表皮葡萄球菌抗生素耐药性分析药敏结果显示,占脑脊液病原菌分布第1位的表皮葡萄球菌对抗菌药物呈不同程度耐药：青霉素(95.2%),红霉素(80.9%),头孢唑林(61.9%),头孢呋辛(61.9%),复方新诺明(57.1%),克林霉素(54.8%),头孢西丁(52.4%),庆大霉素(35.7%),氨苄西林/舒巴坦(33.3%),左旋氧氟沙星(28.6%),利福平(14.3%),磷霉素(9.5%),而对万古霉素和力奈唑烷则有100%的敏感率。5.G杆菌抗生素耐药性分析脑部感染的鲍曼不动杆菌共27株,且抗生素耐药现象多见：头孢噻肟(100%),头孢呋辛(92.6%),头孢他啶(92.6%),环丙沙星(88.9%),哌拉西林(85.2%),哌拉西林/他唑巴坦(85.2%),阿米卡星(85.2%),复方新诺明(85.2%),头孢吡肟(77.8%),美洛培南(74.1%),亚胺培南(70.4%),氨苄西林/舒巴坦(66.7%),头孢哌酮/舒巴坦(48.1%)。铜绿假单胞菌共12株,对不同抗生素的耐药率由低到高依次为美洛培南(25%),头孢他啶(33.3%),头孢吡肟(33.3%),头孢哌酮/舒巴坦(33.3%),阿米卡星(33.3%),亚胺培南(33.3%),左旋氧氟沙星(41.7%),哌拉西林(41.7%),哌拉西林/他唑巴坦(41.7%),环丙沙星(41.7%),复方新诺明(83.3%),头孢噻肟(100%)。6.空肠弯曲菌感染致急性运动性轴索型神经病一例报告患者脑外伤,腹泻和注射单唾液酸四己糖神经节苷脂钠三种诱发因素,导致急性运动性轴索型神经病。该病属于格林巴利综合征亚型。实验室脑脊液检查出蛋白增高,细胞数却正常,呈蛋白-细胞分离状态。空肠弯曲杆菌(CJ)培养(+)。结论：本研究中脑脊液感染主要的病原菌为CNS和鲍曼不动杆菌,相对于VITEK2鉴定方法,利用蛋白质谱技术鉴定病原菌表现出了较高的准确率。革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌对抗生素都表现出较高程度的耐药,因此临床治疗中应充分考虑耐药情况合理选用抗生素。脑外伤、CJ的感染和单唾液酸四己糖神经节苷脂钠都是GBS的潜在危险因素。