论文部分内容阅读
金钱鱼(Scatophagus argus)是一种盐度适应性极强的广盐性硬骨鱼类,尤其对急性盐度胁迫有极强的耐受力,使其非常适合用于研究硬骨鱼类渗透压调节机制。研究这种调节机制不但可以补充完善鱼类细胞生理学、发育生物学等基础研究,同时,掌握鱼类渗透压调节方式和机理,可以为鱼类盐度训养提供理论依据,对海水经济鱼类的淡化养殖非常有意义。1.为更好地了解鱼类的渗透调节机制及能更精确地分析鱼类适应渗透压的特性,建立了金钱鱼肾细胞系(SK)并传代至40代。从细胞水平对金钱鱼肾细胞在渗透压应激作用下的调节机制做进一步分析。金钱鱼肾细胞大都为成纤维样细胞,具有正常的二倍体核型(2n=48)。金钱鱼低渗适应细胞系(SK-la)诱导产生于低渗培养基(150 m Osm)。我们利用显微镜观察、流式细胞仪和Na~+/K~+-ATP酶活检测,探讨不同渗透压(150,300和450 m Osm)对广盐性硬骨鱼类金钱鱼肾细胞SK、SK-la和淡水硬骨鱼类草鱼肾细胞CIK形态、细胞增殖、细胞体积变化及细胞损伤的影响。SK细胞在低渗培养基(150 m Osm)中形态明显变小,且生长速率增加,在高渗培养基(450 m Osm)中形态没有明显变化,但是较等渗培养条件细胞形态稍微变大。SK-la细胞在中度高渗培养基中(300 m Osm)生长良好,但在相对更高渗培养基中(450 m Osm)生长状态不佳,且随着培养基渗透压浓度上升,细胞状态变差,脱离细胞培养瓶表面数越来越多。相比之下,CIK细胞在非等渗透压培养基中生长状态不是很好,其在低渗培养基(150 m Osm)和高渗培养基中(450 m Osm)中生长速率均低于等渗渗透压(300 m Osm)中细胞生长率。非等渗渗透压应激作用SK、CIK细胞的Na~+/K~+-ATP酶活性结果显示,除了SK细胞在低渗培养基的酶活影响不大,其他渗透压应激时的酶活均快速降低。与SK、CIK细胞不同,SK-la细胞在中度高渗渗透压应激下酶活先是升高然后下调。实验结果表明SK、SK-la细胞比CIK细胞对渗透压应激具有更强的调节能力,对广盐性鱼类肾脏在渗透压感应及适应方面的调节机制有更深的了解。2.盐度降低通常会降低鱼的免疫能力,而实验室利用抑制差减杂交构建的c DNA文库结果却显示在迅速的盐度降低后金钱鱼的免疫应答被激活。在实验室建立的金钱鱼转录组文库中,找到Hepcidin基因片段,铁调素(Hepcidin)是参与宿主免疫,富含半胱氨酸的小分子抗菌多肽。我们克隆出两种新型铁调素,金钱鱼铁调素1(SA-hepcidin1)和金钱鱼铁调素2(SA-hepcidin2),SA-hepcidin1属于HAMP1类,c DNA开放阅读框为273bp,编码90个氨基酸,SA-hepcidin2属于HAMP2类,c DNA开放阅读框为267bp,编码88个氨基酸。利用半定量实验进行组织定位,发现SA-hepcidin1主要在肝脏和脑中大量表达,在肾脏、鳃、眼、脾脏、脊索、肠、心脏、皮肤和肌肉中均有表达,而SA-hepcidin2只在肝脏中表达。此外,利用合成的金钱鱼铁调素多肽分析其体外抗菌和抗病毒功能。合成的金钱鱼铁调素对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有相似的抗菌活性,但是SA-hepcidin1比SA-hepcidin2有更强的抗菌作用。利用鲤鱼上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprini,EPC)和草鱼鳍细胞系(grass carp fin,GCF)检测合成的金钱鱼铁调素对鳜鱼弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)和加州鲈鱼呼肠孤病毒(Micropterus salmoides reovirus,Ms Re V)的抗病毒性,发现SA-hepcidin2有抗病毒性,但是SA-hepcidin1没有。研究结果显示,金钱鱼铁调素是参与金钱鱼抵抗各种致病菌免疫系统的重要多功能蛋白。