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一、骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定目的：通过Ficoll密度梯度离心和贴壁分离法体外分离、培养适合实验研究的骨髓间充质干细胞方法：1，无菌条件下取出健康雄性SD大鼠股、胫骨,采用Ficoll密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离纯化BMSCs，显微镜下观察细胞形态和生长情况。传至P3代时，细胞计数并鉴定。2.用成脂、成骨诱导试剂诱导BMSCs向成脂和成骨分化，用油红O染色检测成脂细胞，用VonKossa染色法染色检测成骨细胞。3.用流式细胞鉴定BMSCs表面的抗原标志物CD29、CD34、CD45、CD90。结果:镜下观察BMSCs呈梭形、多角形成纤维细胞样形态,大小一致。BMSCs加入成骨和成脂诱导剂后诱导出成骨和成脂细胞。BMSCs流式细胞仪检测其抗原标志物提示CD29、CD90强阳性，低表达CD45、CD34，细胞纯度高。结论：采用Ficoll密度梯度离心和体外细胞贴壁分离培养法相结合提取的BMSCs，稳定性好，活性高，可以达到实验要求。第二部分足细胞原代的分离、培养及鉴定目的：通过过筛法分离肾小球，胰酶消化破膜后，并进行足细胞原代培养，建立稳定的足细胞原代培养方法，供实验使用。方法：1.无菌条件下取出雄性SD大鼠两侧肾脏，剪碎肾皮质后，用80目，150目，200目网筛分离肾小球，并用光学显微镜下观察肾小球形态。2.收集并用Ⅳ型胶原酶消化肾小球，种植在用Ⅰ型胶原包被的培养瓶中培养，5d后在在显微镜下观察肾小球形态。3.测定细胞表面的上neprin和WT-1抗原。结果：用过筛法可分离出高纯度的肾小球，并用Ⅳ型胶原酶消化后种植在培养瓶中3天后从肾小球中爬出成鹅卵石样细胞，所提取的细胞经足细胞特异性表位WT-1和nephrin鉴定为足细胞。结论：用过筛法结合Ⅳ型胶原酶消化法能培养出细胞，经鉴定培养出的细胞为符合实验要求足细胞。第三部分骨髓间充质干细胞（BMSCs）对肾小球足细胞mTOR的作用研究。目的：探讨BMSCs对保护嘌呤霉素损伤足细胞的作用研究及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)在此过程中的表达；方法：实验分组：正常组：足细胞；嘌呤霉素组：足细胞+嘌呤霉素(5ug/ml)；干细胞组：足细胞+BMSCs（共培养24h）+嘌呤霉素(5ug/ml)；各实验组干预3h后通过普通RT-PCR检测nephrin mRNA和用Western-Blot技术检测nephrin、mTOR、p-mTOR蛋白的的表达。结果：1、普通人体RT-PCR电泳示：正常组、嘌呤霉素组、干细胞组nephrin mRNA的表达无明显差异。2. Western bolt结果示：正常组、嘌呤霉素组、干细胞组nephrin蛋白的表达无明显差异；嘌呤霉素组相比正常对照组p-mTOR蛋白的表达上调；干细胞组与嘌呤霉素组相比p-mTOR蛋白表达明显降低。结论：BMSCs保护嘌呤霉素损伤的足细胞作用可能与mTOR信号转导途径有关。