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矿产资源的合理开发与利用对我国的经济发展有着重要意义。由于不可再生矿产资源日益减少,资源开发过程中环境污染严重,生物冶金技术（Bioleaching）成为资源的高效和绿色开发的有效途径。嗜酸性氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans,简称A.ferrooxidans）是一种极端嗜酸性化能自养菌,具有两套能量代谢系统,既能以亚铁离子,也能利用单质硫和多种还原性无机硫化合物作为唯一能源生长代谢,在生物冶金与环境保护中发挥重要作用。但其能量代谢效率低是该菌广泛应用的主要限制因素。由于研究A.ferrooxidans的亚铁氧化系统和硫氧化系统不仅在理论上对该菌的生理及代谢具有重要意义,而且是该菌在工业上高效应用的基础,因此,深入研究该菌的亚铁和硫氧化机制,提高其亚铁和硫氧化能力,具有重要的理论意义和实践价值。关于嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的亚铁氧化,已有公认的亚铁氧化电子传递模型,cyc2基因编码的Cyc2蛋白被认为是第一个电子受体,推测是决定A.ferrooxidans亚铁氧化效率的关键蛋白。经过本实验室前期研究,获得了cyc2基因敲除突变株△cyc2,结果证明,该突变株仍然具有亚铁氧化能力,说明存在其它功能类似基因发挥作用。通过生物信息学及转录组学验证分析预测AFE1428基因编码的蛋白不管在结构还是序列等方面与Cyc2相似性较高,可能是cyc2的功能替换基因。但是缺少直接实验证据,因此,需要继续研究证明AFE1428基因与A.ferrooxidans亚铁氧化之间的关系。本文成功构建了 AFE1428基因的单敲除株A.ferrooxidans ΔAF1428以及与cyc2基因共敲除的双敲除株A.ferrooxidans △cyc2-ΔAF1428,比较检测了敲除株与野生型相比生长及亚铁氧化能力方面的性质差异,实验结果显示,与野生型相比,在相同亚铁能源条件下,测试菌株的生长能力为:野生型>△AF1428>Δcyc2>△cyc2-ΔAF 1428。亚铁氧化速率排序为:野生型>△ AF1428>△cyc2>△cyc2-△AF1428。数据表明AFE1428基因与cyc2基因一样都参与A.ferrooxidans亚铁氧化,只是cyc2的作用更加重要。利用qRT-PCR测定分析了不同菌株相关基因的转录水平,发现基因敲除株中亚铁氧化电子传递链顺电势途径的基因表达明显上调,逆电势途径的基因表达下调,说明cyc2基因或AFE1428基因的敲除都可能使产生ATP增加,产生还原力减少,所以,总效应是生长减弱,亚铁氧化能力降低。双敲株△cyc2-ΔAF1428仍具有亚铁氧化能力,说明A.ferrooxidans中可能存在其它电子传递途径或仍有其它基因具有类似cyc2的功能,有待进一步研究。关于嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的硫氧化,硫氧化机制尚不完善,尤其单质硫的代谢还不清楚,目前报道有异二硫化物还原酶复合体HdrABC和硫加双氧酶SDO两个系统。实验室前期对编码HdrABC的6个基因（AFE2550-2555）进行了研究,发现这6个基因位于由10个基因组成的hdr操纵子中,该操纵子中紧邻hdrABC上游三个基因 rhd（AFE2558）、tusA（AFE2557）、dsrE（AFE2556）编码蛋白（DsrE,TusA,Rhd）推测可能具硫转移酶功能,在单质硫代谢中起作用,但是尚没有实验证据证明hdr操纵子中AFE2556-2558基因与单质硫氧化的关系。本文选取了硫氧化代谢模型中预测的与单质硫氧化相关的hdr操纵子中三个基因AFE2556-2558为研究对象,通过基因敲除获得了敲除突变株A.ferrooxidans△AF2556-2558,在此的基础上,分别以硫粉、硫代硫酸盐为能源,测定了A.ferrooxidans野生型菌株和△AF2556-2558敲除突变株的生长曲线,并利用qRT-PCR方法测定了以硫粉为能源时相关基因的表达水平。结果显示,当以硫粉为能源进行生长时,A.ferrooxidans野生型菌株和ΔAF2556-2558敲除突变株生长差异较明显,突变株的生长速率及最终生长量均低于野生型菌株,说明这三个基因的敲除对该菌单质硫代谢具有一定的影响,但不是不可缺少的条件。在基因表达方面,△AF2556-2558基因敲除株中各基因的表达趋势与hdr操纵子AFE2550-2555基因的敲除株A.ferrooxidans△hdrABC中的情况基本一致,因此,推测在A.ferrooxidans中AFE2556-AFE2558基因与hdr操纵子中其它基因一起,组成HdrABC系统在A.ferrooxidans单质硫代谢中共同起作用,AFE2556-AFE2558基因编码蛋白的硫转移酶功能还有待进一步研究。综上,本文通过基因敲除、突变株性质研究、基因表达差异分析等手段,分析了A.ferrooxidans亚铁氧化中与电子传递链关键基因cyc2功能类似的AFE1428基因的性质,确定了 AFE 1428基因在A.ferrooxidans亚铁氧化中的作用,为提高该菌亚铁氧化能力的遗传改造提供了线索;确定了与A.ferrooxidans单质硫氧化相关的hdr操纵子中hdr基因簇上游AFE2556-AFE2558三个基因在硫氧化中的作用,为完善该菌硫氧化代谢模型提供了证据,为进一步提高硫氧化能力奠定了基础。