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微小RNA(microRNA)是一类长度在19-23个碱基、非编码功能的小RNA,在许多生物中都有表达。pri-miRNA在细胞内,经过胞核和胞质比如:中一系列的加工修饰后形成成熟的miRNA。成熟microRNA能够通过与靶基因3UTR区结合形成近完全或不完全的配对,导致靶基因mRNA降解,从而调控靶基因的表达。随着生物测序技术的发展,目前在人体中已发现2500多个人源miRNA.研究证明miRNA在多种恶性肿瘤生物学功能中起着重要作用。乳腺癌、胃癌、结肠癌、肝癌和肺癌等。乳腺癌是引起成年女性死亡最常见的肿瘤之一,已发现有多种miRNA的表达异常。miRNA通过调控靶基因影响肿瘤的发生发展是目前的研究热点之一。 目的:研究miR-33a在乳腺癌中的生物学功能,寻找miR-33a在乳腺癌细胞中作用的下游靶基因,并探究其作用的机制。 方法:(1)通过荧光定量PCR和原位杂交的方法检测miR-33a在23例乳腺癌病理组织样品中的表达情况,又通过荧光定量PCR检测了miR-33a在乳腺上皮细胞和乳腺癌细胞株中的表达情况。(2)构建高表达miR-33a的重组质粒载体,通慢病毒转染和筛选获得稳定高表达miR-33a的乳腺癌细胞,荧光定量PCR检测其表达情况。(3)通过体外的MTT实验、平板克隆、Transwell等实验来验证过表达miR-33a对乳腺癌细胞生物功能的影响。同时从反面通过敲低miR-33a来验证miR-33a对乳腺癌细胞生物功能的影响。(4)体内实验通过裸鼠皮下成瘤、尾静脉注射定向肺转移等体内实验来验证过表达miR-33a对乳腺癌细胞成瘤能力和远处转移的影响。(5)在寻找靶基因实验中,结合数据库的预测结果,挑选可能的靶基因,首先通过荧光定量PCR检测这些目的基因在过表达miR-33a的乳腺癌细胞和对照组细胞中的表达情况,挑选其中明显受到过表达miR-33a影响的靶基因,然后通过敲低miR-33a的细胞系进一步验证靶基因,然后进行荧光素酶报告基因实验验证和Western Blot验证,寻找出miR-33a在乳腺癌中的直接靶基因。 结果:(1)荧光定量PCR和原位杂交结果显示miR-33a在乳腺癌病理组织样品中明显低表达,在高转移乳腺癌细胞株中表达量最低。(2) MTT和平板克隆实验表明在MDA-MB-231细胞株中过表达miR-33a能够明显抑制细胞的增值能力,在敲低miR-33a的MCF-7乳腺癌细胞株中,MCF-7细胞株的增殖能力与对照组相比明显增强。(3) Transwell实验表明在MDA-MB-231细胞株中过表达miR-33a能够明显抑制细胞的迁移和侵袭能力,在敲低miR-33a的MCF-7乳腺癌细胞株中,MCF-7细胞株的迁移和侵袭能力与对照组相比明显增强。(4)小鼠皮下成瘤实验和尾静脉肺定向转移实验,证明过表达miR-33a可以明显抑制乳腺癌增殖和远处转移,低表达miR-33a可以促进乳腺癌的增殖和远处转移。(5)荧光定量PCR结果表明,在过表达和低表达miR-33a的乳腺癌细胞株中,ADAM9,ROS1,SOX9和EGR3基因的表达受到明显影响,然后在通过荧光素酶报告基因实验,过表达miR-33a能够明显抑制ADAM9和ROS1基因的荧光素酶活性,最后的Western Blot,ADAM9和ROS1在过表达miR-33a的乳腺癌细胞中,蛋白表达明显受到抑制。 结论:MiR-33a在乳腺癌细胞中低表达,miR-33a在体外能够明显抑制乳腺癌细胞的增殖和转移能力,在体内能够明显抑制乳腺癌瘤球的形成和远处转移。其作用的机制是通过直接与ADAM9和ROS1基因信使RNA的3UTR区结合,干扰ADAM9和ROS1表达,抑制乳腺癌的发生与发展。