研究背景和目的:　　 糖尿病(diabetesmellitus，DM)由多种病因引起的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱，伴有因胰岛素分泌和/或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢异常。该病在临床上的主要病征为“三多一少”，即多饮、多食、多尿、体重减轻。　　 近年来，随着我国社会经济条件的改善，人民生活水平的不断提高，饮食结构的改变，劳动强度的减低，糖尿病患病率在逐渐上升，糖尿病对我国人民健康的影响日趋严重，2009年卫生部与世界糖尿病基金会联合主办的“糖尿病国际论坛”上，与会各方指出，中国糖尿病患者仅次于印度，是世界第二位糖尿病患者的人数已居世界第二位，增长速度惊人。　　 Ⅱ型糖尿病是一种胰岛素抵抗伴β细胞分泌胰岛素不足而导致的，是由基因和环境因素相互影响引起的复杂、多基因性慢性高血糖疾病。据估计，Ⅱ型糖尿病的遗传率达70％-80％。遗传因素在Ⅱ型糖尿病中起主要的发病机理。而且，不同种群的发病率不尽相同，从白种人的5％到亚洲人的50％。　　 Ⅱ型糖尿病多在35～40岁之后发病，占糖尿病患者90％以上。可以通过某些口服药物刺激体内胰岛素的分泌;治疗的短期目标是控制血糖，长期目标是预防相关并发症的发生与发展。其基础治疗方案主要由运动和饮食构成，但是药物治疗和血糖监测往往也非常关键。　　 常规治疗Ⅱ型糖尿病口服药大致分为磺酰脲类、双胍类、噻唑烷二酮类(胰岛素增敏剂)、α-葡萄糖苷酶抑制剂和非磺脲类胰岛素促泌剂。　　 近年来，随着分子生物学的进展，对于糖尿病的发病机制有更深一步的了解，并根据不同的发病机制研发出不同作用机理的新型抗糖尿病药，为临床治疗糖尿病提供多种途径，二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylPeptidaseⅣ，DPPⅣ)抑制剂就是其中的一种。　　 二肽基肽酶-Ⅳ/CD26(DPPⅣ/CD26;EC3.4.14.5)属于脯氨酰寡肽酶家族中的丝氨酸蛋白酶，当氮末端第二位为脯氨酸或者丙氨酸时，DPPⅣ可以在该部位劈开蛋白或多肽。　　 20世纪以来，随着肠促胰岛素(incretin)概念的提出和研究的深入，该领域的研究越来越受到人们的重视;因其具有保护和促进胰岛β细胞增殖，促进胰岛素分泌同时抑制胰高血糖素分泌等作用而备受研究者青睐。但肠促胰岛素主要成分胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素肽(glucose-dependentinsulinotropicpeptide，GIP)在体内易受DPPⅣ降解而半衰期很短暂，无法起到生理活性作用。对DPPⅣ抑制剂的研究成为糖尿病治疗研究的一个新热点，并且取得了显著的成效，以磷酸西他列汀(sitagliptinphosphate，Januvia)为代表的不同类型的小分子DPPⅣ抑制剂不断涌现，成为极具前景的Ⅱ型糖尿病新治疗策略。　　 目前，国外对DPPⅣ抑制剂的研究较为深入，主要通过Caco-2细胞或动物肝肾组织细胞提取液获取DPPⅣ，与特异性底物甘氨酰-脯氨酰-对硝基苯胺(Gly-Pro-pNA)反应的方式来构建抑制剂筛选模型，而国内对DPPⅣ抑制剂体外筛选模型的研究匮乏。本研究旨在建立一个简便，快捷，高效的DPPⅣ抑制剂的体外筛选模型，并通过模型快速寻找该类抑制药物。　　 本实验建立的筛选模型是对本实验室已有的DPPⅣ抑制剂筛选模型的细胞破碎液、底物浓度、pH，孵育时间三个条件进行优化。实验采用L9(34)正交实验，以酶比活力做判断的指标，考察以上三个条件对模型的影响，以期达到减少能耗、更快捷地进行抑制剂的筛选，为以后对批量化合物的DPPⅣ抑制活性进行高通量筛选提供依据。以高浓度的sitagliptin为阳性对照，纯水代替sitagliptin为阴性对照测定Z因子、信噪比S/N，评价筛选模型的优劣;设置液氮、-20℃、4℃、25℃、37℃作为放置温度分别保存不同时间，检测细胞破碎液中DPPⅣ的活性;从1％-30％梯度设置7个体积浓度的DMSO、乙醇、乙酸乙酯，考查常用的有机溶媒对DPPⅣ活性的影响;利用实验测出的DPPⅣ动力学参数Km，vmax的判断化合物JD-1，JD-2抑制的性质;使用本筛选模型筛选一系列合成的化合物对DPPⅣ抑制的活性。　　 方法:　　 1.Caco-2细胞中DPPⅣ的提取、蛋白质含量测定于含10％胎牛血清，1％非必需氨基酸，1％谷氨酰胺的DMEM高糖培养基培养Caco-2细胞。反复冻融方法破碎细胞，取上清液，-70℃保存。考马斯亮蓝G-250法测细胞破碎液的蛋白质量。共测10管，1.00mg·mL-1BSA为标准蛋白，分别加入不同体积的纯水、考马斯亮蓝染料试剂和细胞破碎液。用标准蛋白浓度(mg·mL-1)为横坐标，用OD595nm为纵坐标，使用MicrosoftOfficeExcel2003得标准曲线，代入公式求得未知样品的蛋白质含量。　　 2.正交实验本正交试验选定4因素3水平考察本筛选模型最适反应条件。具体为100％，70％，50％细胞破碎液;100μM，200μM，300μM底物(GLy-Pro-pNA)溶液;8.3，8.0，9.0pH;15min，30min，60min孵育时间。到反应时间后分别于405nm测OD值，并计算各组合的酶比活力值(μmoL·min-1·g-1)，采用SPSS13.0进行统计分析。　　 3.Z，信噪比(S/N)100μMsitagliptin溶液为阳性对照，纯水代替sitagliptin为阴性对照，共设20复孔，37℃孵育15min后，405nm测OD值，根据公式计算Z及S/N。　　 4.不同浓度DMSO、乙醇、乙酸乙酯对筛选模型中DPPⅣ活性的影响DMSO、无水乙醇、乙酸乙酯浓度设定为1％，5％，10％，15％，20％，25％，30％。以纯水代替有机溶剂为阴性对照，37℃孵育15min后，405nm测OD值，数据以Mean±SD表示，用MicrosoftOfficeExcel2003对抑制率进行回归分析及SPSS13.0对不同浓度有机溶剂之间的差异进行统计分析。　　 5.在不同温度(37℃，25℃，4℃，-20℃，-70℃，液氮)放置不同时间对DPPⅣ稳定性的影响将细胞破碎液分成3组，25℃、37℃为第一组，4℃为第二组，液氮、-70℃、-20℃为第三组。25℃、37℃存放的细胞破碎液测定为每2h测定一次OD值，并于第24h测最后一次OD值，共6次;4℃存放的细胞破碎液测定为存放4℃的1天后、每2天测一次及第30天，共9次;液氮、-70℃、-20℃的细胞破碎液测定为每隔1星期测定一次，共6次。用MicrosoftOfficeExcel2003对酶活性变化进行回归分析及SPSS13.0对不同温度放置之间的差异进行统计分析。　　 6.DPPⅣ动力学参数(Km，vmax)的测算对所求得不同底物浓度时反应的初始速度v和各对应的初始底物浓度[S]作倒数，采用MicrosoftOfficeExcel2003软件，以1/v为纵坐标，以1/[S]为横坐标作回归曲线，并拟合回归方程，即可计算得到Km，vmax值。　　 7.JD-1，JD-2对DPPⅣ抑制作用性质的判断JD-1，JD-2分别设6个浓度，加入不同浓度底物溶液，求得各酶促反应的初速度v。对所求得同一抑制剂浓度，不同底物浓度时反应的初始速v和各对应的初始底物浓度[S]作倒数，用MicrosoftOfficeExcel2003软件，以1/(v)为纵坐标，以1/[S]为横坐标作回归曲线，并拟合回归方程，即可计算得到Km，vmax值。Km，vmax与Km，vmax比较，判断JD-1，JD-2对DPPⅣ抑制作用性质，并按公式计算出抑制剂Ki。　　 8.受试化合物抑制率的测定受试化合物与阳性对照物sitagliptin以3％乙醇溶液溶解，以3％乙醇溶液代替受试化合物作阴性对照，每组设3个复孔。冰浴孵育30min后，37℃孵育15min后，405nm测吸光度(OD)值，并计算抑制率。　　 结果:　　 1.正交实验结果显示细胞破碎液(A)、底物浓度(B)、pH(C)、孵育时间(D)的最佳组合为:(稀释)50％细胞破碎液、300μM底物浓度、pH8.3、孵育时间15min。在实验选择的评价水平中，底物浓度对筛选模型的影响最大，pH影响最小，顺序为B＞D＞A＞C;各因素间及水平间的P值均小于0.05，具显著性差异。　　 3.筛选模型的评价中Z、信噪比(S/N)分别为0.775、16.411。　　 4.不同浓度DMSO、乙醇、乙酸乙酯对筛选模型中DPPⅣ活性的影响，结果显示当DMSO、乙醇、乙酸乙酯的溶度到30％时，酶活性降低至77.06％、74.87％、75.58％。从统计分析看，15％起与1％相比，对酶的活性影响有统计学意义　　 5.在不同温度(37℃，25℃，4℃，-20℃，-70℃，液氮)放置不同时间对DPPⅣ稳定性的影响。25℃与37℃对DPPⅣ活性的影响具有显著性差异，在第6h及6h后，与原始的(0h)相比，活性的下降均具统计学差异。在4℃的近期保存中，第3d及3d后，与原始的(0d)相比，活性的下降均具统计学差异。在液氮、-70℃、-20℃中保存到第6周，DPPⅣ活性分别降低至67.5％，60.0％，62.0％，液氮分别-70℃，-20℃对酶活性有显著性差异。　　 6.JD-1，JD-2对DPPⅣ抑制作用性质的判断。本实验求得筛选模型的DPPⅣ的Km，与Vmax分别为100.7μM与2.105μM·min-1。从双倒数图求得，JD-1，JD-2及sitagliptin的Km/Vmax(斜率)随浓度增大，1/Vmax(纵轴截距)不变，均为竞争性抑制剂。　　 7.受试化合物抑制率的测定。在一系列的待测化合物中，WL-01、Wl-04的浓度为1×106nM抑制率超过50％，分别为63.51％±0.98％，73.18％±1.53％　　 结论:　　 使用正交实验结果的模型评价中Z大于0.5，S/N大于5，说明本筛选模型准确性、重复性和稳定性好，可用于高通量筛选。实验结果显示，在对化合物需使用有机溶剂溶解时，可优先选取低于15％的DMSO。通过实验的观察，25℃、37℃24h下，37℃对酶的活性影响相对较小;25℃与37℃对DPPⅣ活性的影响具有显著性差异，在37℃放置更稳定。4℃30天后对DPPⅣ活性有较大的影响，放置不宜过长;在液氮、-70℃、-20℃保存6周后对酶活性有一定的影响，三者中，-70℃对DPPⅣ活性影响较小。本实验求得的筛选模型中DPPⅣ的Km为100.7μM，与文献报道的接近。利用双倒数图求得，JD-1，JD-1与sitagliptin均属于竞争性抑制剂，与相关文献报道的sitagliptin抑制性质一致。使用本筛选模型，在一系列的化合物对DPPⅣ抑制的筛选中，获得WL-01、Wl-04的浓度为1×106nM抑制率超过50％，可做进一步的分析。