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目的：缺血性脑卒是导致死亡和残疾的主要原因。虽然过去几十年中开发了多种新的实验性神经保护策略，但在临床转化上仍面临着很大的困难。因此，寻找新的治疗靶点以作为脑卒中溶栓治疗的辅助疗法仍是临床所需要的。环状 RNA （circRNA）在中枢神经系统中高度表达，其功能失调涉及多种神经系统疾病。本课题组的前期研究表明，抑制circTLK1的表达可以减轻缺血性脑卒中后神经元损伤，促进神经功能恢复，而过表达circDLGAP4则可以保护卒中后血脑屏障的完整性。然而，circRNA在缺血性脑卒中病理进展中的潜在作用仍未阐明。本研究发现在急性缺血性脑卒中（acute ischemic stroke，AIS）患者血浆中circRNA FBXW4（circFBXW4）表达显著下调，因此本研究以circFBXW4为切入点，旨在探究circFBXW4在缺血性脑卒中的作用及机制，揭示了circRNA作为脑卒中生物标志物的潜力，并为脑卒中治疗靶点的开发提供理论依据。
方法：（1）应用circRNA微阵列技术筛选AIS患者血浆中差异表达的circRNA。（2）应用Real-time PCR方法在AIS患者血浆以及短暂性大脑中动脉闭塞模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠血浆和脑组织中验证大数据结果。（3）小鼠脑微注射circFBXW4过表达慢病毒后进行tMCAO造模，应用2，3，5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色检测tMCAO小鼠脑梗死体积；在复灌后3，7，14，21，28天检测小鼠行为学和神经功能学评分。（4）荧光原位杂交技术检测circFBXW4 在小鼠脑内细胞的分布。（ 5 ）应用超高速离心分离肉瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白（ fused in sarcoma/translocated in liposarcoma，FUS/TLS）聚集体并用western blot检测。（6）免疫荧光染色、western blot 检测缺血脑组织胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达。（7）在离体细胞水平，利用原代培养的星形胶质细胞制备氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型，转染 circFBXW4 过表达慢病毒后 western blot 检测 HECTD1，LC3B-Ⅱ， IQGAP1等蛋白的表达。
结果：（1）circFBXW4 在 AIS 患者血浆和 tMCAO 小鼠血浆及脑组织中表达降低。（2）过表达circFBXW4显著改善tMCAO小鼠神经功能损伤程度、减小脑梗死体积，促进神经功能恢复。（3）circFBXW4在小鼠脑内主要分布于星形胶质细胞中，过表达circFBXW4抑制tMCAO小鼠脑中GFAP表达增加，抑制星形胶质细胞活化。（4）通过生物信息学分析发现circFBXW4与FUS相互结合，而FUS在缺血性脑卒中后形成聚集体，过表达circFBXW4可抑制缺血损伤导致的FUS聚集。（5）敲低FUS抑制HECTD1的表达，过表达circFBXW4通过FUS/HECTD1轴抑制星形胶质细胞活化。（6）HECTD1泛素化底物IQGAP1在缺血再灌后表达降低，过表达IQGAP1可抑制星形胶质细胞活化，IQGAP1参与circFBXW4介导的星形胶质细胞活化。
结论：本论文研究表明，circFBXW4通过结合并吸附FUS，抑制缺血性脑卒中后FUS聚集，增加FUS的游离形式，从而上调下游靶蛋白HECTD1及其泛素化底物 IQGAP1 的表达，并随后抑制星形胶质细胞活化。本研究结果为 circFBXW4在脑缺血中的潜在作用机理提供了新的证据。
方法：（1）应用circRNA微阵列技术筛选AIS患者血浆中差异表达的circRNA。（2）应用Real-time PCR方法在AIS患者血浆以及短暂性大脑中动脉闭塞模型（transient middle cerebral artery occlusion，tMCAO）小鼠血浆和脑组织中验证大数据结果。（3）小鼠脑微注射circFBXW4过表达慢病毒后进行tMCAO造模，应用2，3，5—氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色检测tMCAO小鼠脑梗死体积；在复灌后3，7，14，21，28天检测小鼠行为学和神经功能学评分。（4）荧光原位杂交技术检测circFBXW4 在小鼠脑内细胞的分布。（ 5 ）应用超高速离心分离肉瘤融合/脂肪肉瘤转运蛋白（ fused in sarcoma/translocated in liposarcoma，FUS/TLS）聚集体并用western blot检测。（6）免疫荧光染色、western blot 检测缺血脑组织胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）的表达。（7）在离体细胞水平，利用原代培养的星形胶质细胞制备氧糖剥夺/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）模型，转染 circFBXW4 过表达慢病毒后 western blot 检测 HECTD1，LC3B-Ⅱ， IQGAP1等蛋白的表达。
结果：（1）circFBXW4 在 AIS 患者血浆和 tMCAO 小鼠血浆及脑组织中表达降低。（2）过表达circFBXW4显著改善tMCAO小鼠神经功能损伤程度、减小脑梗死体积，促进神经功能恢复。（3）circFBXW4在小鼠脑内主要分布于星形胶质细胞中，过表达circFBXW4抑制tMCAO小鼠脑中GFAP表达增加，抑制星形胶质细胞活化。（4）通过生物信息学分析发现circFBXW4与FUS相互结合，而FUS在缺血性脑卒中后形成聚集体，过表达circFBXW4可抑制缺血损伤导致的FUS聚集。（5）敲低FUS抑制HECTD1的表达，过表达circFBXW4通过FUS/HECTD1轴抑制星形胶质细胞活化。（6）HECTD1泛素化底物IQGAP1在缺血再灌后表达降低，过表达IQGAP1可抑制星形胶质细胞活化，IQGAP1参与circFBXW4介导的星形胶质细胞活化。
结论：本论文研究表明，circFBXW4通过结合并吸附FUS，抑制缺血性脑卒中后FUS聚集，增加FUS的游离形式，从而上调下游靶蛋白HECTD1及其泛素化底物 IQGAP1 的表达，并随后抑制星形胶质细胞活化。本研究结果为 circFBXW4在脑缺血中的潜在作用机理提供了新的证据。