目的：探讨细胞增殖在环孢素A(CsA)慢性肾损伤中的作用及中药复方制剂柴苓汤对其的影响，为临床防治CsA肾毒性提供实验依据。方法：第一部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾功能及肾组织病理形态学的影响1动物分组、模型复制及药物治疗40只雌性SD大鼠随机分为四组，即对照组(Control)、模型组(CsA)、柴苓汤组(CsAC)及缬沙坦组(CsAV)，每组10只。采用CsA30mg/(kg·d)经口灌服28天的方法，建立慢性CsA肾病大鼠模型。对照组每日灌胃给与等容量橄榄油。造模的同时，两治疗组分别给予柴苓汤3g/(kg·d)和缬沙坦10mg/(kg·d)治疗，模型组和对照组则每日给予等容量生理盐水。2指标检测2.1体重及尿液检测每周末将所有大鼠移入代谢笼中，分别测量每只大鼠体重、24小时尿量及尿肌酐。2.2肾脏病理形态学检测切取大鼠左侧肾脏组织，4%多聚甲醛固定，常规制作石蜡切片后分别行HE、Masson及PAS染色，观察肾组织病理形态改变，并参照Katafuchi评分标准从炎性细胞浸润、间质纤维化、肾小管萎缩三方面对肾小管间质损伤程度进行分析。2.3肾功能检测实验第29天，所有大鼠被处死，取血以检测大鼠血尿素氮(BUN)及血清肌酐(SCr),并计算出肌酐清除率(CCr)。3统计分析数据资料以均数±标准差（±s）表示，使用SPSS16.0统计软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平以0.05和0.01为标准。第二部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏增殖细胞核抗原表达的影响1动物分组、模型复制、药物治疗及统计分析方法同第一部分。2指标检测实验第29天，取大鼠部分肾脏组织，分别采用免疫组化、Western-Blot、RT-PCR及流式细胞术四种方法检测大鼠肾脏PCNA表达。2.1免疫组化：采用SABC法，以光镜下肾脏组织出现棕黄色颗粒为阳性表达。2.2Western Blot:切取100mg-70℃冰箱中保存的肾组织，提取蛋白并定量，依次进行电泳，转膜，免疫反应及显色。最后用富士LAS-4000LIMINESCENT图像分析仪拍照。2.3RT-PCR：根据Trizol RNA抽提试剂盒要求，切取100mg液氮保存的肾组织，提取肾皮质总RNA，并反转录合成cDNA进行PCR反应。取10L产物在1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下拍照，应用BIO-PROFIF凝胶图像分析系统进行分析。2.4流式细胞术：取70%酒精固定的肾组织，制作肾间质、肾小管单细胞悬液后，离心沉淀2分钟。取0.1ml单细胞悬液(细胞密度为1×106个/mL)，加入碘化丙啶，4℃冰箱避光染色30min，以500目铜网过滤。采用美国Beckton Dickinson公司FACScan-420型流式细胞仪检测PCNA荧光指数(FI)、细胞凋亡率及细胞周期，并根据公式(PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%计算出增殖指数(PI)。第三部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响1动物分组、模型复制、药物治疗及统计分析方法同第一部分。2指标检测实验第29天，取大鼠部分肾脏组织，分别采用免疫组化、Western-Blot、RT-PCR检测大鼠肾脏CTGF的表达。操作步骤同第二部分。第四部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏纤维连接蛋白表达的影响1动物分组、模型复制、药物治疗及统计分析方法同第一部分。2指标检测实验第29天，取大鼠部分肾脏组织，分别采用免疫组化、Western-Blot、RT-PCR检测大鼠肾脏FN的表达。操作步骤同第二部分。结果：第一部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾功能及肾组织病理形态学的影响1体重及尿量检测结果实验第一、二周，所有大鼠体重均有所增加，但同时段各组间比较无明显差异（P＞0.05）。随着实验时间的延长，模型组大鼠体重增长减缓，至第四周末，模型组体重较前一周反而下降，且与同时段两治疗组相比有显著差异（P＜0.01）。实验的前3周，四组大鼠24小时尿量比较无明显差异（P＞0.05）。然而至实验第4周末，模型组尿量较其余三组显著减少（P＜0.05）。2病理形态学检测结果HE染色结果：对照组未见明显异常；模型组肾间质大量炎性细胞浸润，同时可见肾小管上皮细胞坏死、脱落；柴苓汤组及缬沙坦组肾脏损伤程度明显轻于模型组。Masson染色结果：对照组肾间质可见少量胶原成分。模型组肾间质胶原成分大量沉积，并呈条带状分布；柴苓汤及缬沙坦组肾间质胶原成分较模型组明显减少。半定量分析结果表明，模型组肾小管间质损伤各项参数积分值均明显高于对照组（P＜0.01）。与模型组相比，两治疗组各项参数积分值则明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。PAS染色结果：模型组肾小球基底膜增厚，细胞基质沉积增多，系膜细胞增生明显。柴苓汤组及缬沙坦组大鼠肾组织病理损伤较模型组显著减轻。3肾功能检测结果与对照组比较，模型组血肌酐、尿素氮水平明显升高（P＜0.01），但同时该组肌酐清除率显著降低（P＜0.01）。柴苓汤组及缬沙坦组血肌酐、尿素氮水平较模型组明显降低（P＜0.01），肌酐清除率则均较模型组明显升高（P＜0.05）。两治疗组间比较无明显统计学差异（P＞0.05）。第二部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏增殖细胞核抗原表达的影响1免疫组化结果对照组仅见少量PCNA阳性细胞。模型组阳性细胞较对照组明显增多（P＜0.01）。柴苓汤及缬沙坦组PCNA阳性细胞较模型组显著减少（P＜0.01），但两治疗组相比无明显统计学差异（P＞0.05）。2Western-Blot结果对照组肾组织PCNA蛋白仅少量表达，与之相比，模型组表达增强（P＜0.01）。经柴苓汤及缬沙坦治疗，PCNA蛋白表达被下调（P＜0.05），两治疗组相比无明显差异（P＞0.05）。3RT-PCR结果与对照组相比，模型组PCNAmRNA表达明显增强（P＜0.01）。柴苓汤及缬沙坦均可下调PCNAmRNA高表达（P＜0.05），两治疗组相比无明显统计学差异（P＞0.05）。4流式细胞术结果4.1荧光指数模型组荧光指数明显高于对照组（P＜0.01）；与模型组比较，柴苓汤组及缬沙坦组荧光指数显著降低（P＜0.01）。4.2细胞周期模型组处于S期的细胞比例较对照组增多（P＜0.01），而处于G0/G1期的细胞比例较对照组减少（P＜0.01）；柴苓汤及缬沙坦组处于S期的细胞比例较模型组明显降低（P＜0.01），处于G0/G1期的细胞比例较模型组增多（P＜0.01）。各组G2/M期细胞比例相对接近，组间比较无统计学差异（P＞0.05）。4.3增殖指数、凋亡率与对照组比较，模型组肾脏细胞增殖指数明显升高（P＜0.01），凋亡率较对照组也有所增加，但两组凋亡率的差异没有统计学意义（P＞0.05）。模型组凋亡率/增殖指数的比值显著低于对照组（P＜0.01)；与模型组比较，柴苓汤组及缬沙坦组增殖指数均明显降低（P＜0.01），凋亡率则分别升高（P＜0.01，P＜0.05)，凋亡率/增殖指数的比值也提高（P＜0.01）。第三部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏结缔组织生长因子表达的影响1免疫组化结果对照组大鼠肾脏组织CTGF蛋白表达为弱阳性。模型组CTGF蛋白表达明显增强，主要表达在肾小管上皮细胞及间质细胞。经柴苓汤及缬沙坦治疗后，CTGF蛋白表达显著减弱。2Western-Blot结果对照组大鼠肾组织CTGF蛋白表达量很少，与之相比，模型组则显著增强，柴苓汤组及缬沙坦组CTGF蛋白表达较模型组明显减少。3RT-PCR结果与对照组相比，模型组CTGFmRNA表达明显增强（P＜0.01），柴苓汤组及缬沙坦组CTGFmRNA表达较模型组明显降低（P＜0.05）。第四部分：柴苓汤对慢性环孢素A肾病大鼠肾脏纤维连接蛋白表达的影响1免疫组化结果对照组FN蛋白少量表达，主要见于肾小管上皮细胞；模型组FN蛋白表达较对照组明显增强；经柴苓汤及缬沙坦治疗后，FN蛋白表达明显减少。2Western-Blot结果对照组肾组织FN蛋白仅少量表达，与之相比，模型组表达增强，柴苓汤及缬沙坦均可显著下调FN的高表达。3RT-PCR结果与对照组相比，模型组FNmRNA表达明显增强（P＜0.01）。柴苓汤组及缬沙坦组FNmRNA表达均显著减少（P＜0.01）。结论：1柴苓汤可减轻CsA诱导的肾脏病理损害，改善肾功能。2柴苓汤可通过下调慢性CsA肾病大鼠肾组织PCNA的高表达及调节细胞周期，抑制细胞增殖活动，延缓肾间质纤维化的进程。3柴苓汤可抑制慢性CsA肾病大鼠肾组织中CTGF蛋白及基因的表达，从而延缓肾间质纤维化进程。4柴苓汤可抑制慢性CsA肾病大鼠肾组织中FN的合成及表达，减少细胞外基质沉积，减轻肾间质纤维化程度。