【实验目的】肝细胞癌(HCC)是全球第六大常见恶性肿瘤,是癌症相关死亡的第四大主要原因。慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC的主要危险因素之一。最近,癌症代谢的重编程已被确定为癌症的标志。HCC中从氧化磷酸化代谢途径向糖酵解途径的转变不仅满足了肝癌细胞快速增殖的需求,还为肿瘤的发展提供了良好的微环境。HBV DNA聚合酶(HBV-DNA-Pol)具有逆转录酶(RT)和DNA聚合酶的活性,可以调节HBV复制,先天免疫等多种生物学功能。近期有研究发现,HBV-DNA-Pol在肝癌细胞生长中起关键作用,但是HBV-DNA-Pol是否通过影响HCC的糖代谢来影响HCC的恶性行为还不是很清楚。在本实验室的前期研究中,我们通过大量的体外实验证实了HBV-DNA-Pol可以促进肝癌细胞的细胞活性、增殖能力、迁移和侵袭能力等,并通过免疫共沉淀结合质谱分析发现许多与HBV-DNA-Pol相互作用的蛋白。本课题着重研究HBV-DNA-Pol是否可以通过调控肝癌的代谢进程来影响肝癌的发生发展。【实验方法】首先,我们通过一系列的体外实验(MTT实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移侵袭实验)验证了实验室的前期结果,然后使用G418筛选了稳定表达HBV-DNA-Pol的Hep G2多克隆细胞株,通过裸鼠实验建立肝癌生长和肺转移模型。其次,我们查阅之前的质谱分析结果发现肝型糖原磷酸化酶(PYGL)可能与HBV-DNA-Pol存在相互作用,构建PYGL的过表达和敲降质粒,通过免疫共沉淀实验和免疫荧光实验分析两者相互作用及共定位。接着使用实验室前期构建的三个HBV-DNA-Pol的缺失质粒,通过免疫共沉淀实验确定HBV-DNA-Pol与PYGL结合的具体结构域。通过RT-q PCR、Western blot及免疫组化实验检测HBV-DNA-Pol对PYGL表达的影响。为了排除HBV其他蛋白对PYGL表达的影响,RT-q PCR及Western blot检测HBs Ag、HBe Ag和HBx对PYGL的m RNA及蛋白水平的影响。使用溶酶体及蛋白酶体抑制剂处理肝癌细胞,确定PYGL蛋白降解的主要途径,通过放线菌酮实验,蛋白质泛素化分析等相关实验方法探究HBV-DNA-Pol调控PYGL表达的可能机制。随后应用定量实验、ELISA、PAS染色及高分辨MS等实验检测HBV-DNA-Pol发生改变后肝癌细胞内糖原代谢及糖酵解过程中相关分子表达的变化,另外我们还检测了异种移植肿瘤内糖原和乳酸的变化。最后通过一系列挽救实验验证HBV-DNA-Pol对肿瘤表型及糖代谢的影响是通过PYGL发挥作用的。【实验结果】体内外实验证实HBV-DNA-Pol促进了肝癌的恶性行为。HBV-DNA-Pol与PYGL相互作用并在肝癌细胞的细胞质内共定位。HBV-DNA-Pol不影响PYGL的m RNA水平,但可通过减少蛋白酶体降解和增强PYGL的蛋白质稳定性来增加HCC细胞中PYGL的蛋白水平。TRIM21是PYGL的E3泛素连接酶,可以降低肝癌细胞内PYGL的表达。由于TRIM21可同时与HBV-DNA-Pol及PYGL结合,但HBV-DNA-Pol与TRIM21的亲和力更强,因此竞争性地损害了PYGL与TRIM21的结合从而抑制了PYGL的泛素化,上调了肝癌细胞内PYGL的蛋白水平。HBV-DNA-Pol通过上调PYGL的表达增强糖原磷酸化酶的活性,促进糖原分解,使更多的G-1-P异构为G-6-P,进入到糖酵解过程产生更多的乳酸和能量。在肝癌细胞中,PYGL发挥着癌基因的作用。挽救实验发现敲降PYGL后可以减弱HBV-DNA-Pol对肝癌细胞恶性行为的促进作用。【实验结论】本实验研究证实了HBV-DNA-Pol,TRIM21都可与PYGL相互作用,并且TRIM21可以促进PYGL经泛素-蛋白酶体途径降解,HBV-DNA-Pol与TRIM21的强相互作用减弱了TRIM21对PYGL的泛素化修饰,从而上调了肝癌细胞中PYGL的蛋白水平,PYGL的增加促进糖原分解,导致葡萄糖进入糖酵解的流量增加,最终促进HCC的发展。