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人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种无包膜的环状闭合双链 DNA 病毒,以特异感染人类皮肤和粘膜上皮为特征。迄今,经鉴定和测序的 HPV 基因型已超过 100 多种。根据 HPV 所致疾病的恶性程度,可将其分为高危型和低危型。高危型 HPV(如 HPV16、18、31)与生殖道、皮肤及喉部鳞状细胞癌密切相关,其基因组整合入宿主细胞染色体中,引起细胞恶性转化,致病机制已基本阐明;而低危型 HPV(如 HPV6、11)引起尖锐湿疣等良性增生,很少发展成为恶性,所以长期以来不被重视。 由于缺乏对尖锐湿疣发病机制的了解,至今对尖锐湿疣只能进行对症治疗。近年来,随着尖锐湿疣的发病率大幅度上升,人们逐渐认识到“低危并不等于不重要”,从病因学入手,研究低危型 HPV,特别是最常见的 HPV11 的作用机制显得尤为重要与迫切。 已知高危型 HPV E6 蛋白可以通过泛素蛋白水解途径特异性的降解细胞 p53 蛋白。由于 p53 能够通过 p21WAF1/CIP1间接导致 G1 期阻滞,使细胞赢得时间,在进入 S 期前修复损伤的 DNA。E6 引起的 p53 的降解,解除了 p53 对生长的负向调节功能。这就允许遗传改变的细胞继续增殖,导致基因组不稳定进而引发肿瘤。由于低危型 HPV 和高危型HPV 的基因组结构和核酸序列具有高度一致性,因此可以推断低危型HPV E6 蛋白也有相似的作用机制。 本研究选用低危型 HPV 中有代表性的 HPV11 为研究对象,主要目的是通过构建带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的 HPV11E6 基因重庆医科大学硕士研究生学位论文 4的真核表达质粒,应用体外(in vitro)基因转染技术将该质粒转染入人真皮成纤维细胞,进而研究 HPV11E6 对该细胞 p53 蛋白稳定性的影响,借以了解 HPV11E6 的功能,为进一步全面阐明 HPV11 引起尖锐湿疣的机制奠定一定的基础。本研究主要由三部分组成:一、HPV11E6 基因绿色荧光蛋白真核表达载体的构建和鉴定根据已知的 HPV11E6 序列,设计在目的片段两端分别带 BamHI和 EcoRI 酶切位点的引物。用 PCR 方法以质粒 pBR322/HPV11 为模板扩增该基因片段,经 BamHI 和 EcoRI 双酶切后回收纯化,定向克隆至含有以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的真核表达质粒 pIRES2-EGFP中。重组质粒 pIRES2-HPV11E6-EGFP 经限制性酶切和 DNA 序列测定证明构建正确,为研究 HPV11E6 在细胞内的功能提供了一个方便而重要的工具。二、重组质粒 pIRES2-HPV11E6-EGFP 在人真皮成纤维细胞中的表达取临床包皮组织,用含氨苄青霉素和硫酸链霉素的 PBS 反复漂洗后,剪弃脂肪和结缔组织。将皮肤剪成 1mm3左右的小块,胶原酶和透明质酸酶消化,离心细胞加入 DMEM,在 37℃、5%CO2 培养箱中培养,形态学观察鉴定。收获处于指数生长期的成纤维细胞约 1×105个,将细胞接种于 6 孔细胞培养板中培养 24h,使细胞达到 50-80%融合。用转染试剂 DOTAP,按照说明书将 pIRES2-HPV11E6-EGFP 质粒转染入成纤维细胞。转染后 12h,在荧光显微镜下可以观察到荧光蛋白的表达3,6-48h为荧光蛋白表达的高峰期;收集细胞提取RNA后,用RT-PCR方法检测细胞总 RNA 中目的基因 mRNA 的表达,结果为阳性,说明在转录水平有目的基因的表达。三、HPV11E6 在人真皮成纤维细胞内功能的初步研究