我国农田土壤重金属污染严重,植物修复被认为是一项绿色经济的重金属污染土壤修复技术。利用超积累植物提取污染土壤重金属是实现高效移除土壤中重金属的方法之一。东南景天(Sedum alfredii Hance)是中国原生的锌/镉超积累植物,在我国重金属污染土壤修复应用中具有巨大的潜力。而剖析植物超积累重金属的关键调控机制是进一步通过农艺措施或遗传改良工程优化污染土壤植物修复技术的关键所在。然而,以往有关东南景天超积累重金属的机制研究大多集中于生理层面,其超量吸收、转运和积累重金属的分子调控机制尚不完全清楚。研究表明,PCR家族(Plant Cadmium Resistance)和HMA家族(Heavy Metal transporting ATPases)转运蛋白介导了植物体内锌、镉等二价阳离子的吸收运输过程。课题组前期研究发现,SaPCR2和SaHMA2在东南景天吸收累积镉过程中起着重要的调控作用,但两者在东南景天吸收和累积锌中的作用及机制尚不明确。基于此,本论文以超积累植物东南景天为主要研究对象,采用现代分子生物学和同步辐射Micro-XRF等技术,较系统地研究了SaPCR2和SaHMA2在调控东南景天吸收与累积锌过程中的主要功能。取得的主要结果如下:(1)实时荧光定量分析结果表明,SaPCR2在超积累东南景天根部高量表达,且缺锌处理后SaPCR2表达量轻微上调,而在高锌处理条件下其表达量呈下降趋势。采用醋酸锂转化法将SaPCR2转入锌镉敏感型酵母Δzrc和锌吸收缺陷型酵母ZHY3,发现SaPCR2在Δzrc中的异源表达增加了酵母对锌的吸收,降低了其对高锌胁迫的耐性,而在ZHY3中表达SaPCR2后恢复了突变体菌株的生长。结合“SaPCR2定位于细胞质膜”的前期结果,我们推测SaPCR2是东南景天根部负责锌从细胞外向细胞内跨膜运输的转运蛋白。进一步采用农杆菌转化法将SaPCR2在非超积累生态型东南景天中过表达后发现,与野生型植株相比,SaPCR2过表达植株对锌的吸收与积累显著增加,但对铁、锰、铜等元素的吸收无明显变化。采用μ-XRF原位分析了锌在转基因植株中的分布特征,发现在野生型非超积累东南景天植株茎中,锌信号弱且集中在维管组织,而SaPCR2过表达植株中锌信号强,并大量分布在维管组织、皮层和表皮中。可见,SaPCR2过表达促进了转基因植株根系对锌的吸收及其随后向地上部的转运。这进一步证实了SaPCR2转运蛋白在东南景天根部介导了锌的跨膜运输过程,促进了根系对锌的吸收量,从而提高了植物根部与地上部对锌的积累能力。进一步分析SaPCR2过表达植株根部锌的原位分布特征发现,SaPCR2过表达植株根系中锌在伸长区区域的积累量较高。相比于野生型植株,锌处理对SaPCR2过表达植株根系生长具有明显的抑制作用,主要表现为根系短粗丛生,尤其是根伸长区生长严重受抑。表达量分析结果表明,SaPCR2在根伸长区的表达水平显著高于根尖。综上,SaPCR2主要介导了超积累东南景天根系(尤其是伸长区)细胞对锌的吸收作用,对锌的吸收积累能力、根系生长均具有重要的调控作用。(2)采用实时荧光定量分析,比较研究了SaHMA2在超积累东南景天不同部位中的表达差异。结果表明,SaHMA2在超积累东南景天的根和茎中高量表达,且在根基部的表达量显著高于根尖,而不同锌处理对SaHMA2的表达量无显著影响。采用农杆菌转化法将SaHMA2转入非超积累东南景天后,鉴定得到3个过表达的独立株系。水培试验结果表明,SaHMA2的过表达显著增加了非超积累东南景天对锌的积累,以及木质部汁液中的锌含量。同时,木质部汁液中的铁、锰含量也略有增加,但对植物中的铁、锰含量无显著影响。对SaHMA2过表达植株水培外源添加锌处理后,转基因植株幼叶和根尖中锌含量的增加水平显著高于野生型,表明SaHMA2与锌积累在新生器官有关。可见,SaHMA2介导了锌在木质部的装载过程,且可能与锌从成熟器官向新生器官的韧皮部再转运有一定的关系。综上所述,SaPCR2与SaHMA2转运蛋白在超积累东南景天根系分别对锌的吸收和木质部装载过程中起到重要调控作用,从而实现地上部锌的超量积累,为利用基因工程优化植物修复、提高农产品生物强化技术提供理论参考。