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本研究以矮牵牛为实验材料,农杆菌介导法将雪花莲凝集素(GNA)基因导入矮牵牛,获得转基因植株,旨在通过表达GNA提高转化植株的抗虫性。本论文工作主要包括高频再生体系的建立、Km筛选压浓度的确定、转化体系的建立、转基因植株的检测及移栽,具体如下:
1.高频再生体系的建立
取无菌苗叶片,接入诱导分化培养基MS+0.1mg/LNAA+3mg/L6-BA上可诱导再生出芽,再生频率达到95%以上;将幼苗放在生根培养基1/2MS+1mg/LIAA上,生根率达100%。
2.Km筛选压浓度确定
将无菌苗叶片接种到含有不同Km浓度的分化培养基中,测验其对愈伤诱导的抑制效果。结果表明抑制叶盘愈伤分化的筛选压Km浓度为25mg/L。
3.矮牵牛叶盘遗传转化体系的建立
矮牵牛的最适转化条件:用OD600=0.5的农杆菌菌液侵染叶片15min,放在MS+0.1mg/LNAA+3mg/L6-BA上,暗培养3d,转入MS+0.1mg/NAA+3mg/L6-BA+100mg/LCef+25mg/LKm培养基上进行选择培养,直至再生出芽,将再生芽转入1/2MS+1mg/LIAA+10mg/LKm生根筛选培养基上诱导生根。
4.转基因植株的PCR检测
提取农杆菌质粒DNA和经过Km筛选的转化植株总DNA,进行目的基因PCR扩增。经电泳检测,24个抗性植株中有14个扩出了与阳性对照相同的特异性条带,初步证明目的基因已插入植物基因组中。
5.转基因植株的PCR-Southern杂交检测
取5棵PCR为阳性植株做PCR-Southern杂交,结果表明,5棵转基因植株均有与阳性对照相同的特异性条带,也表明目的基因已插入植物基因组中。
6.转基因植株的移栽
将生根的转基因植株移栽后,转移到温室中生长。