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目的:明确丝氨酸/精氨酸蛋白特异激酶2(serine/arginine-rich protein specific kinase 2,srpk2)m RNA及编码蛋白产物在小鼠睾丸组织不同细胞中的差异表达特征;进一步运用分子克隆技术构建srpk2的真核表达质粒并建立srpk2过表达HEK293T细胞模型;分析srpk2过表达对HEK293T细胞增殖和细胞周期的影响,及其与微管结构的相互关系,为深入探讨该基因在精子发生中的作用及意义奠定基础。方法:1.利用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)分析小鼠睾丸组织四种细胞系中srpk2基因m RNA的差异表达;2.利用蛋白免疫印迹技术(Western blotting)分析小鼠睾丸组织四种细胞系中srpk2基因编码蛋白产物的表达;3.应用免疫组化和免疫荧光技术检测SRPK2蛋白在小鼠睾丸组织的细胞定位;4.通过免疫荧光双重染色观察SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在生精细胞中的定位分布;5.利用分子克隆技术构建srpk2真核表达重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2;6.采用RT-PCR和Western blotting检测重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2转染HEK293T细胞后srpk2 m RNA和蛋白的表达水平;7.通过CCK-8和流式细胞术分别检测过表达srpk2后HEK293T细胞增殖能力和细胞周期变化;8.采用间接免疫荧光双重染色检测SRPK2蛋白和α-Tubulin蛋白在HEK293T细胞中的定位分布;9.采用Western blotting检测srpk2过表达对聚合态和未聚合态微管蛋白影响。结果:1.实时定量PCR和Western blotting检测结果显示srpk2在小鼠精母细胞(GC2-spd)、小鼠支持细胞Sertoli(TM4)、小鼠间质细胞Leydig(TM3)中的表达水平相近,而在小鼠精原细胞(GC1-spg)中的表达水平较低;2.免疫组化结果表明SRPK2蛋白在曲精小管中的所有细胞均有分布,但在精子发生后期的长形精子细胞阶段相对集中,同时间质细胞也可见到阳性信号;3.免疫荧光分析显示SRPK2蛋白定位在精原细胞的胞浆,精母细胞和圆形精子细胞的胞浆和胞核都有分布,发育后期主要集中在长形精子细胞核附近,在间质细胞定位于胞浆;4.免疫荧光双重染色结果显示SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白在长形精子细胞核附近存在明显的共定位关系;5.DNA测序结果表明重组质粒p LV-EGFP(2A)Puro-srpk2构建成功;6.重组质粒转染HEK293T细胞后,经RT-PCR和Western blotting检测表明srpk2基因在HEK293T内实现了过表达;7.CCK-8检测结果显示过表达srpk2组HEK293T细胞的增殖率明显高于空载体组及裸细胞组(P<0.05),流式细胞术检测发现过表达组HEK293T细胞的G1期明显降低(P<0.05),差异均有统计学意义;8.细胞免疫荧光双重染色分析显示在HEK293T细胞内过表达的SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在共定位关系;9.Western blotting结果表明srpk2过表达可增加聚合态微管蛋白含量,而减少未聚合态微管蛋白含量。结论:1.srpk2在小鼠睾丸组织精原细胞、精母细胞、间质细胞Leydig、支持细胞Sertoli中均有表达,并且SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在明显的共定位关系;2.成功构建了srpk2的真核表达质粒,转染HEK293T细胞后,能够促进细胞增殖能力,缩短细胞周期G1期,过表达SRPK2蛋白与α-Tubulin蛋白存在共定位关系并对微管聚合具有促进作用。