重组人肾素受体的表达、复性及同时纯化研究

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近年来,蛋白折叠液相色谱(PFLC)法以其众多优点已被广泛地用于生物大分子的复性及纯化中:即在迅速除去变性剂的同时可以高效地复性并纯化目标蛋白质,并且可以回收变性剂。本论文在大肠杆菌(E.coli)中高效表达出重组人肾素受体(rhRnR),经超声破碎、离心、洗涤后获得的包涵体溶解在8.0 mol/L脲或7.0 mol/L盐酸胍中得到rhRnR的变性抽提液,再利用高效疏水相互作用色谱(HPHIC)法、高效离子交换色谱(HPIEC)法、高效排阻色谱(HPSEC)法对其进行复性并同时纯化研究。本论文分为以下四部分:1.文献综述:主要介绍近几年来蛋白质复性方法的进展以及PFLC法的原理和它的优势,同时介绍了RnR的生理学和药理学功能以及其表达纯化的研究进展。2. rhRnR在E.coli中的高效表达:考察了培养基种类、诱导表达时间对rhRnR表达量的影响,以及变性剂种类对rhRnR溶解及复性效果的影响。实验结果表明当采用M9为培养液、诱导表达时间为4h时rhRnR的表达量最高,其脲变性抽提液中的蛋白含量为7.1 mg/mL;采用8.0 mol/L脲作变性剂更有利于rhRnR的复性,利用疏水色谱饼复性后可获得两种目标蛋白,其可能是两种不同分子构象的rhRnR或是以二聚体和单体形式存在的rhRnR,纯度和质量回收率分别为:目标蛋白1:79.3%和30.2%;目标蛋白2:94.6%和62.4%。3. HPIEC法复性并同时纯化rhRnR包涵体:本章节主要考察了HPIEC流动相条件(pH值、脲浓度)和进样量,以及rhRnR变性液中添加表面活性剂(也称为去垢剂)对rhRnR复性效果的影响。结果表明利用HPIEC法复性rhRnR只得到以单体形式存在的目标蛋白,最优条件下,可在30min内对rhRnR进行复性并同时纯化。将用HPIEC复性的rhRnR再利用HPSEC进一步纯化,得到了可能以单体和部分二聚体形式存在的两种目标蛋白,对HPSEC流动相进行优化后,最佳流速条件下得到rhRnR的纯度和质量回收率分别为:二聚体:100%和12.43%;单体:100%和7.82%,这为rhRnR的三维结构分析和其生理学、病理学的研究奠定了基础;另一方面发现给rhRnR变性抽提液中添加去垢剂Triton X-100可有效减少rhRnR的聚集,提高rhRnR的复性产率。利用HPIEC-HPSEC法对其复性后,两个目标蛋白峰的纯度和质量回收率分别为:二聚体:92.8%和62.7%;单体:93.5%和18.3%。4. HPHIC法复性并同时纯化rhRnR包涵体:主要考察了色谱柱规格、流动相条件(pH值、脲浓度)和进样量对rhRnR复性效果的影响。结果表明在最优条件下,复性后rhRnR的纯度和质量回收率分别为:目标蛋白1:82%和23.4%;目标蛋白2:100%和63%。
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