论文部分内容阅读
目的：1.在体外建立脐血CD34+细胞向自然杀伤细胞(natural killer cell, NK细胞)诱导分化体系,并研究不同的细胞因子组合对NK细胞表型、分化机制、增殖、杀伤活性的影响。2.探讨rhIL-15在CD34+细胞向NK细胞诱导分化过程中的作用及相关机制。方法：1.纯化脐血来源的CD34+细胞取脐静脉血稀释后,用淋巴细胞分离液密度梯度离心法收集脐血单个核细胞(cord blood-mononuclear cell, CB-MNC)。利用MACS富集CB-MNC内的CD34+细胞备用,流式细胞仪检测其纯度。2.建立CD34+细胞向NK细胞诱导分化体系将纯化的脐血来源CD34+细胞以1×105/ml的起始密度接种于24孔板,每孔加入1m1完全RPMI1640培养基(含10%热灭活的胎牛血清,10-6mol/LHDC)。根据加入细胞因子的不同,实验分为3组：A组(SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7+IL-15)、B组(SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7)、C组(SCF+FLT-3L+IL-7)。C组细胞培养3周后分为C1、C2、C3三组,相应加入IL-2、IL-15、IL-2+IL-15继续诱导分化2周,每组设3个复孔。所用细胞因子浓度为SCF20ng/ml、FLT-3L10ng/ml、IL-2500U/ml、IL-720ng/ml、IL-1510ng/ml。置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养5周,每3-4天半量换液,全量补充细胞因子。3.细胞增殖和免疫表型分析每周以细胞计数法检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞免疫表型。检测指标如下：A、B两组中CD3-CD56+NK细胞的比例；C组中CD34brightCD122+NK祖细胞的比例；C1、C2、C3组中NK细胞的比例。4.CCK-8法检测NK细胞杀伤活性检测对象为：诱导分化5周的A、B组NK细胞和脐血活化的NK细胞。活化的NK细胞由脐血单个核细胞经IL-2500U/ml和IL-1510ng/ml刺激2周获得,用来与诱导分化NK细胞的杀伤活性相比较。所用靶细胞为Hela细胞和K562细胞。5. real-time PCR法检测相关基因的表达A、B组诱导分化的NK细胞和CD34+细胞检测肿瘤坏死因子、颗粒酶B、穿孔素、干扰素-γ、bcl-2、bax、STAT5A、 STAT5B的表达水平。结果：1.分选前CB-MNC中CD34+细胞仅占2.46%,经过MACS分选后CD34+细胞比例到达88.7%。每份脐血可获得(3-6)×105个CD34+细胞。2.根据流式细胞仪检测结果,A、B两组细胞诱导培养5周后,NK细胞比例分别为61.59%、17.91%；平均每个CD34+细胞可诱导获得的NK细胞数分别为122个及21个；共表达NKG2D受体的CD56+NK细胞比例分别为73.4%、57.5%。以上数据说明IL-15可以提高NK细胞的诱导分化效率和扩增倍数,促进NK细胞表达NKG2D受体。C组细胞诱导培养3周后,NK祖细胞比例达到23.1%,分别以IL-2、IL-15、IL-2+IL-15继续刺激2周后,C1、C2、C3组中NK细胞比例分别为7.45%、14.14%、16.83%,说明SCF+FLT-3L+IL-7的组合能够诱导产生NK祖细胞,IL-15能够促进其分化发育为成熟NK细胞。3.杀伤实验中,各组细胞在效靶比为10：1时杀伤效果最强。A组对K562细胞和Hela细胞的杀伤率为24.7%和19.5%；B组对K562细胞和Hela细胞的杀伤率最低,分别为10.7%和8.5%。提示IL-15能够提高NK细胞的杀伤活性。4. Real time PCR结果显示,A、B组NK细胞中肿瘤坏死因子、颗粒酶B、穿孔素、干扰素-γ表达水平较CD34+细胞明显提高,且A组基因表达水平比B组高。说明诱导分化的NK细胞具有分泌细胞因子的能力,IL-15能够促进NK细胞分泌细胞因子。A组bcl-2、STAT5A、STAT5B、bcl-2/bax=2.356表达水平较B组升高。提示IL-15可能通过JAK3-STAT5通路介导CD34+细胞向NK细胞分化,通过上调bcl-2表达抑制细胞凋亡结论：1.脐血源CD34+细胞可以在体外诱导分化为NK细胞,最佳细胞因子组合为SCF+FLT-3L+IL-2+IL-7+IL-15。2.诱导分化产生的NK细胞主要为CD56bright亚群,具有分泌细胞因子和杀伤肿瘤细胞的能力。3.使用SCF、FLT-3L、IL-7组合可以诱导CD34+细胞分化为NK祖细胞,表型为CD34brightCD122+。4.IL-15可促进CD34+细胞定向分化为NK细胞,并增强其非MHC限制性的细胞毒作用。