目的:英国前瞻性糖尿病研究(UKPDS)结果表明,2型糖尿病患者在初诊时,胰岛功能多已低于正常的50％,并随着糖尿病时间的推移,胰岛β细胞功能呈进行性受损。而胰岛β细胞凋亡异常增多是导致胰岛β细胞数量减少的重要原因,如何保护残存的胰岛β细胞及通过对β细胞的保护来延缓糖尿病的进展,仍然是糖尿病治疗领域的难点和热点问题。　　 2型糖尿病体内升高的血糖、血脂诱发体内氧化与抗氧化作用失衡并引起氧化应激,是导致胰岛β细胞损伤和糖尿病发生发展的一个重要原因。大量葡萄糖进入细胞内使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生增多,促发氧化应激,激活NF-κB途径,增加了诱生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的转录,使NO合成增加。NO可通过多种途径引起胰岛β细胞凋亡,同时过量的NO可与超氧阴离子结合生成氧化作用更强的过氧亚硝基阴离子(peroxynitrite,ONOO-),其对胰岛β细胞具有超强的细胞毒性,可造成β细胞凋亡,ONOO还可使蛋白质的酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝基化反应,最终形成产物硝基酪氨酸(nitrotyrosine,NT),蛋白质被硝基化后,可诱导酶活性丧失、细胞坏死及凋亡。　　 吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)为二硫氨基酸酯,其分子上含有巯基(thiol)结构,具有抗氧化及金属螯合作用。PDTC可以特异性抑制NF-κB活性,有效抑制氧化应激所致的NF-κB的过度表达,已有多项研究证实,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平,但其机制尚不清楚。本研究以高脂喂养加小剂量链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)腹腔注射的方法建立2型糖尿病大鼠模型,并用PDTC(50mg·kg-1·d-1)干预1周后,通过检测血糖水平、胰腺组织中SOD和GSH-PX活力、MDA含量、胰腺组织中iNOS表达和NT的生成以及胰岛β细胞凋亡的情况,旨在整体水平确定PDTC对糖尿病大鼠的降糖作用及其对抗氧化应激、硝化应激对胰腺β细胞损伤的保护作用。　　 方法:　　 1：动物模型建立、分组及标本处理　　 参照M.J.Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型,37只健康雄性Wistar大鼠,8周龄,体重180-210g,随机分为对照组(NC组)12只和高脂喂养组(HFD组)25只,对照组给予基础饲料喂养,高脂组给予高脂饲料喂养,8周后行糖耐量实验,高脂喂养组证实出现胰岛素抵抗时,给予一次性腹腔注射链脲佐菌素27mg/kg,对照组大鼠给予同体积柠檬酸缓冲液腹腔注射腹腔注射,各组以原饲料继续喂养。72小时后测血糖值,以随机血糖≥16.7 mmol/L者为2型糖尿病大鼠,证实造模成功,共成模24只。成模组随机取12只给予PDTC50mg/kg/d进行腹腔注射治疗。正常对照组和糖尿病组每日给予同体积的生理盐水腹腔注射。　　 各组大鼠每周监测血糖和体重。每组大鼠于腹腔注射STZ前后均做口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)和胰岛素耐量试验(insulin tolerance test,ITT)。大鼠自采血前一日20:00开始禁食,第二日8:00分别从内眦静脉取血3ml,分离血浆,用于检测胰岛素、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(highdensity lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(lowerdensity lipoprotein-cholesterol,LDL-C)、游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)。PDTC治疗1周后处死动物,留取胰腺组织分别检测超氧化物歧化酶(superoxide diamutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase,GSH-PX)的活性及丙二醛(malonaldehyde,MDA)的含量,iNOS、NT的表达及胰岛β细胞凋亡率。　　 2：血糖、胰岛素的测定　　 采用葡萄糖氧化酶法测定血糖,ELISA法测定胰岛素。通过稳态模型胰岛素抵抗指数(homeoestasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR)及胰岛素敏感指数(insulin sensitivity index,ISI)评价胰岛素抵抗的程度,HOMA-IR=LN(FBG×FINS/22.5)表示胰岛素抵抗的程度,胰岛素敏感指数ISI=IN(1/FBG×FINS),表示胰岛素敏感性。　　 3：口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)　　 口服葡萄糖耐量实验:给予2g/kg葡萄糖灌胃,分别测定灌胃后0、30min、60min、90min、120min的血糖、胰岛素水平,并计算每只大鼠葡萄糖曲线下面积(area under the curve,AUC)。　　 胰岛素耐量实验:给予1U/kg生物合成人胰岛素腹腔注射,分别测定各组大鼠注射后0、15min、30min、60min、90min的血糖水平。　　 4：血脂的测定　　 甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)均使用全自动生化分析仪测定,游离脂肪酸(FFA)采用Cu2+比色法测定。　　 5：胰腺组织SOD、GSH-Px活性和MDA含量的测定　　 取胰腺组织200mg,制备10％胰腺组织匀浆,低温离心机3000r/min,离心10-15min,留取上清,按照试剂盒说明分别测定SOD、GSH-Px的活力及MDA含量。　　 6：大鼠胰岛组织形态学观察　　 取胰尾部分胰腺组织用10％福尔马林固定24小时后,梯度酒精脱水,石蜡包埋。石蜡切片,切片厚度为4μm,HE染色观察胰岛的一般形态学变化,免疫组化检测胰腺组织内iNOS的表达及NT生成量。　　 7：胰岛素与PI双染色法,流式细胞术检测胰岛β细胞凋亡率。　　 经70％乙醇固定的胰腺组织,制备单细胞悬液,用碘化丙啶(propidium iodide,PI)和FITC标记的胰岛素抗体(anti-Insulin/FITC)双染色法,4℃染色30 min,流式细胞仪(flow cytometry,FCM)测定β细胞凋亡百分率。　　 8：统计学处理　　 计量资料以-x±s表示,采用SPSS13.0软件进行统计分析。两组间差异用两样本均数的t检验进行比较,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),检验标准α=0.05,P＜0.05为有统计学差异。　　 结果:　　 1：STZ注射前各组大鼠指标比较；　　 1.1：各组大鼠体重比较实验初各组大鼠体重无统计学差异,按照分组喂养不同饲料,实验第8周,高脂喂养组大鼠体重(body weight,BW)(361.92±19.22g)明显高于对照组(313.17±19.95g),差别具有统计学意义(P＜0.01)。　　 1.2：各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR、ISI比较实验第8周高脂喂养组空腹血糖与对照组相比尚无统计学意义,高脂组大鼠空腹胰岛素水平(fasting plasma insulin,FINS)(18.01±2.63μIU/ml)明显高于对照组(10.67±0.83μIU/ml),有统计学差异(P＜0.01);高脂喂养组大鼠HOMA-IR(1.22±0.17)高于对照组(0.68+0.09)有统计学差异(P＜0.05);高脂喂养组大鼠ISI(-4.43±0.17)低于对照组(-3.79±0.09)有统计学差异(P＜0.05)。　　 1.3：各组大鼠口服葡萄糖耐量实验(OGTT)及胰岛素耐量实验(ITT)比较STZ注射前,OGTT:对照组大鼠葡萄糖灌胃后30min血糖达高峰,高脂喂养组大鼠90min血糖达高峰,各时间点血糖水平均较对照组明显升高,其中90min、120min两个时间点血糖水平比较有统计学差异;高脂组大鼠葡萄糖曲线下面积(AUC)(27.91±2.16)明显高于正常对照组(25.65±1.44)有统计学差异(P＜0.05);葡萄糖刺激后β细胞胰岛素释放功能结果:高脂组各时间点胰岛素水平较对照组明显升高,均有统计学差异(P＜0.01)。　　 STZ注射前,ITT:高脂喂养组大鼠腹腔注射胰岛素后15min、60min、90min三个时间点血糖水平均明显高于对照组比较有统计学差异(P＜0.05)。　　 1.4：各组大鼠血脂水平比较高脂组大鼠TC(8.79±1.83mmol/L)、TG(1.12±0.32mmol/L)、LDL(5.65±1.34mmol/L)、FFA(1.84±0.14mEq/L)分别明显高于正常对照组TC(2.18±0.11mmol/L)、TG(0.66±0.07mmol/L)、LDL(1.00±0.06mmol/L)、FFA(1.27±0.13mEq/L),均有统计学差异(P＜0.05)。　　 2：造模后各组大鼠指标比较；　　 2.1：各组大鼠空腹血糖及空腹胰岛素比较　　 8周末,高脂组腹腔注射STZ72h后,高脂组FBG(26.16±3.38mmol/L)明显高于对照组(4.41±0.56mmol/L)有统计学差异(P＜0.01)。经PDTC治疗1周后,FBG(11.55±2.89mmol/L)明显低于糖尿病组(26.55±2.90mmol/L),有统计学差异(P＜0.01),但仍明显高于对照组(5.58±4.43mmol/L)。　　 2.2：各组大鼠葡萄糖耐量实验(OGTT)及胰岛素耐量实验(ITT)比较　　 经PDTC治疗1周,OGTT结果显示:PDTC治疗组各时间点血糖均明显低于糖尿病组,其中120min时间点血糖水平比较有统计学差异(P＜0.05),PDTC治疗组葡萄糖曲线下面积(63.06±25.27)明显低于糖尿病组(101.83±16.89)(P＜0.05)。　　 ITT结果显示:PDTC治疗组各时间点血糖明显低于糖尿病组,其中0min、15min时间点血糖比较有统计学差异(P＜0.05)。　　 2.3：各组大鼠胰腺组织内SOD、GSH-Px活力及MDA含量比较　　 糖尿病组大鼠胰腺组织SOD、GSH-Px活力明显低于正常对照组(P＜0.01),PDTC治疗后大鼠胰腺组织SOD、GSH-Px活力明显高于糖尿病组(P＜0.05或P＜0.01);糖尿病组大鼠的MDA含量明显高于正常对照组(P＜0.01),PDTC治疗组大鼠的MDA含量明显低于糖尿病组(P＜0.01)。　　 2.4：各组大鼠胰岛组织形态学变化　　 HE染色显示:低倍镜下可见NC组大鼠胰腺胰岛形状规则,胰岛内细胞排列紧密,细胞核呈紫蓝色,大而圆,核清晰,胞浆丰富;DM组大鼠胰岛结构明显破坏,胰岛内β细胞数量明显减少,并且β细胞内出现不同程度空泡样变;PDTC治疗组大鼠胰岛β细胞数目较糖尿病组明显增多,胰岛结构明显改善。　　 免疫组化显示:糖尿病组大鼠胰腺组织中iNOS表达及NT的生成量均明显高于正常对照组(P＜0.01);PDTC治疗组大鼠胰腺组织中iNOS表达及NT的生成量均明显低于糖尿病组(P＜0.01)。　　 2.5：流式细胞术检测　　 胰岛β细胞凋亡率糖尿病组大鼠胰岛β细胞凋亡率(22.44±5.15％)明显高于正常对照组(10.35±1.95％)(P＜0.01);PDTC治疗组大鼠胰岛β细胞凋亡率(12.14±4.66％)明显低于糖尿病组(P＜0.05)。　　 结论:　　 1：在高脂饮食喂养的基础上,给予小剂量链脲佐菌素腹腔注射可成功复制2型糖尿病大鼠模型。　　 2：高糖、高脂状态下可促发氧化应激,iNOS的表达和NT生成增多是胰岛β细胞的损伤的重要原因。　　 3：PDTC对糖尿病大鼠不仅具有降血糖作用,还可以减轻糖尿病体内氧化应激反应,减少iNOS的表达及NT生成,进而减少胰岛β细胞的凋亡。