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目的构建含共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL等目的基因片段的重组质粒标准品,建立检测这些共刺激分子mRNA表达水平的Taqman探针实时荧光定量PCR方法。并检测上述共刺激分子在不同年龄段健康人及癌症患者中的表达情况,探讨共刺激分子与衰老及肿瘤的关系。方法第一部分:以从一例组织(胃腺癌)中提取的总RNA为模板、Random 9 mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL的目的基因表达片段,构建PBS-TⅡ- CD28/ CTLA-4/ CD86/ CD40L/ ICOS/ICOSL/β-ACTIN重组质粒,鉴定测序后,用Taqman探针荧光定量PCR制作标准曲线。第二部分:收集165例(20-88岁)健康人外周血标本,按不同年龄段分为6组,采用实时荧光定量PCR技术的方法检测共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL mRNA在不同年龄段健康人群外周血的表达量并进行比较,以探讨共刺激分子与衰老的关系。第三部分:采用实时荧光定量PCR技术的方法检测共刺激分子CD28、CTLA-4、ICOS、ICOSL mRNA在食管癌及肺癌患者外周血的表达量,并检测比较ICOS/ICOSL mRNA在胃腺癌组织及相应癌旁组织的表达量。结果第一部分:组织提取的总RNA完整性良好,构建的CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL重组质粒测序结果与目的片段一致,原始质粒标准品倍比稀释后用Taqman探针荧光定量PCR检测,CTLA-4、CD86质粒标准品在E12-E4 copies/mL,CD28、CD40L、ICOS、ICOSL质粒标准品在E12-E3 copies/mL线性关系良好(R~2=1)。第二部分:(1)各年龄段中不同性别的每种共刺激分子的mRNA表达量比较无统计学意义。(2)健康人外周血中CD28、ICOS mRNA的表达水平随着年龄的增加降低,而CTLA-4 mRNA表达情况则相反。(3)健康人外周血中CD86、CD40L、ICOSL mRNA的表达水平与年龄无相关性(P>0.05)。第三部分:(1)51-70岁年龄段的食管癌及肺癌患者外周血中CD28、ICOS、CTLA-4 mRNA的表达水均低于健康人。(2)胃腺癌组织中ICOS mRNA表达水平低于相应癌旁组织。(3)CD28、CD40L、ICOS、ICOSL mRNA的表达量在不同临床分期、癌的类型、分化程度及有无淋巴转移等的分组比较无统计学意义(P>0.05)。结论1.成功建立Taqman探针实时荧光定量检测CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL基因表达的方法。2.随着年龄增加共刺激分子基因表达水平的变化可能与衰老的发生及发展有关。3.癌症患者外周血或组织中活化性共刺激分子基因表达水平的降低,可能是肿瘤免疫逃避的表现。4.患者外周血CTLA-4 mRNA的过低表达提示机体免疫功能下降。