环指E3泛素连接酶TaGW2L调控小麦抽穗时间的机制研究

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小麦抽穗期能直接影响小麦的开花时间、成熟期、抗逆性以及产量,是一种能反映小麦生长发育阶段转变(营养生长-生殖生长)的重要的农艺性状。而RING型E3泛素连接酶通过介导底物蛋白降解在调控植物生长发育及胁迫响应中发挥了重要作用。本研究同源克隆了TaGW2类似基因TaGW2-like(简称TaGW2L),并系统分析了两个基因之间的分子特性,再通过一系列生化试验及转基因过表达、基因编辑植株的表型鉴定,探究TaGW2L在调控小麦抽穗期方面发挥的作用,得到以下结论:1.TaGW2L是一个定位在细胞核和细胞质中的组成型表达基因。通过检索Ensembl Plants中的小麦数据库发现与TaGW2序列相似性达50%的基因TaGW2L,与TaGW2的A、B、D组氨基酸序列一一比对发现两者具有高度相似性,特别是含有RING finger结构域的N端相似度更高。构建载体转入小麦原生质体后发现TaGW2L蛋白在小麦细胞中的分布位置为细胞核和细胞质,与TaGW2蛋白分布位置相似。取样中国春不同时期不同组织的样品进行时空表达特征分析,发现TaGW2L与TaGW2具有相似的时空表达模式,在各个时期各个组织中均有表达,是典型的组成型表达基因。2.TaGW2L是一个主要调控小麦抽穗期的正向因子。构建转基因过表达和基因编辑载体,并将其导入小麦品种Fielder中,经过PCR鉴定、纯化培养后,使用T3代进行表型鉴定。在大田与温室两种环境下,统计分析TaGW2L过表达株系(TaGW2L-OE)与野生型(WT)的诸多农艺性状,发现在大田条件下,OE比WT提前抽穗6.5-8.5天,在温室条件下,OE比WT提前抽穗6.8-9.1天,而其他农艺性状中除了株高略有差异之外,其他性状之间的差异均不显著。转录组数据显示,与WT相比,OE中多个已知正调控小麦抽穗期的基因显著上调,与表型数据结果一致。T3代的TaGW2L基因编辑小麦(TaGW2L-ED)在温室环境下纯化培养后,提取DNA扩增测序发现具有2种基因编辑类型(均为ABD纯合),初步观察发现2种编辑类型均比WT延迟抽穗10天左右。3.TaGW2L可能通过泛素-蛋白酶体途径和诱导关键的春化和光周期调控因子的表达发挥调控小麦抽穗期的作用。通过体外泛素化试验表明含RING finger结构域的TaGW2L蛋白具有E3活性,且在酵母中发现表达的TaGW2L蛋白全长具有自激活活性,将其分段检测后发现N2(1-221)段不具有自激活活性,用于后续的酵母双杂筛选试验。经过筛选发现大多数克隆为泛素-蛋白酶体相关蛋白,挑选TaE2(Traes CS3D02G271400)进行互作验证,证实两者之间具有较强的相互作用。转录组数据也支持TaGW2L通过调控TaVRN1、TaVRN3和TaCO1促进小麦抽穗的可能性,且发现CCT和MADS-box家族基因的诱导表达可能也在TaGW2L-OE小麦提前抽穗中发挥了作用。综上,TaGW2L是一个与TaGW2序列、亚细胞定位、时空表达特征相似的典型的组成型表达基因,表达的TaGW2L蛋白也具有E3泛素连接酶活性,但是两者在功能上存在分化,通过转基因过表达和基因编辑小麦植株发现TaGW2L是一个主要正向调控小麦抽穗期的RING型E3。
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