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1.目的 原发性血小板减少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP)是一种临床常见的出血性疾病,其发病原因尚未完全阐明。本研究重点在于阐明在于紫癜颗粒与气虚血瘀型慢性ITP之间方证相关性。首先,综述近年ITP证候学研究的概况及气虚血瘀证病理研究进展;其次,论述紫癜颗粒的立法组方依据;通过实验验证紫癜颗粒的药效学效应,同时通过动物在体实验和血清药理学技术观察气虛血瘀型慢性ITP的病理基础和紫癜颗粒益气活血、祛瘀止血的作用环节。 2.方法 采用免疫造模方法,即用豚鼠抗BALB/c小鼠血小板血清(APS)给BALB/c小鼠腹腔注射,建立慢性ITP模型。按血小板计数随机分组,以相对公认的气虚和血瘀指标,摸索免疫法ITP动物模型形成的变化规律,并通过紫癜颗粒治疗效果反证该动物模型气虚血瘀证的证候特点;利用上述模型血浆中ET-1及eNOS含量及肾小球内皮细胞超显微结构的变化探讨慢性ITP的气虚血瘀病机特点及紫癜颗粒的方证相关性;利用ITP病人血清刺激人脐静脉内皮细胞,采用血清药理学方法,观察内皮细胞ET-mRNA/eNOSm/RNA表达的变化及紫癜颗粒的调整作用。分别从整体、器官、细胞、分子四个不同层次,通过在体和离体两种方法探讨紫癜颗粒与慢性ITP之间的方证相关机理。 3.结果 3.1.ITP的药效学指标 3.1.1.紫癜颗粒对ITP模型小鼠外周血小板的影响 结果显示:与正常组比较,模型组小鼠血小板计数明显下降(P<0.05),出凝血时间明显延长(P<0.05),CD41(抗GPⅡb抗体)、CD61(抗GPⅢa抗体)的含量均显著降低(P<0.05)、骨髓巨核细胞数和未成熟的巨核细胞数一致性增多,而产板型巨核细胞却减低(P<0.05)。表明ITP出血与血小板数量减少、凝集功能降低及结构变化有关;同时,ITP模型小鼠骨髓巨核细胞增生伴有成熟障碍。在提升血小板计数方面,紫癜颗粒大剂量和醋酸泼尼松组优于其他各组(P<0.05);紫癜颗粒大剂量组明显缩短出凝血时间(P<0.05);紫癜颗粒大剂量组可以显著升高血小板膜糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa)含量,紫癜颗粒的大、中剂量组可以抑制不成熟的骨髓巨核细胞的增生,促进产板型巨核细胞的产生,但紫癜颗粒大剂量组优于血康组、泼尼松组及紫癜颗粒小剂量组。表明造模成功,紫癜颗粒对ITP动物模型的良好药效。 3.1.2.气虚血瘀证的药效学指标 模型组在注射APS48小时后,腹部、尾部出现不同程度的瘀斑瘀点;造模后紫玻颗拉治疗慢性原发性血小板减少性紫斑方证相关性的实验研究第5天小鼠即出现活动减少、拱背、竖毛、毛发不光洁,游泳时间显著缩短(P<0.05),体重明显下降(P<0.05);紫疲颗粒对上述症状都有不同程度的改善作用,总体上以颗粒大剂量组效最佳。3.2.紫疲颗粒对工TP模型小鼠肾小球血管内皮细胞超显微结构变化的影响 结果所见:模型组毛细血管内皮细胞变化明显。细胞核外形成不规则变化,异染色质浓缩成团块状分布在核内,胞质内可见线粒体(Mi)尚可,粗面内质网(HER)扩张表面核糖体脱落,说明在ITP状态下内皮细胞形态学的改变.与空白组比较,紫疲颖粒治疗组无明显差异.表明紫疲颗粒能够纠正ITP状态下内皮细胞形态学的改变。3.3.紫疲颗粒对ITP模型血管内皮因子的影响 结果显示:与正常组比较,模型组小鼠外周血浆内皮素(ET一1)与降钙素基因相关肤(CGRP)含量均明显升高(P<0.肠),但是ET一1/CGRP比值有所提高高,表明ITP状态下血中收缩因子含量增高,血管呈现收缩状态,会使血液循环受阻,反映了慢性ITP气滞血癖的证候特点。紫疲颗粒治疗组,对ET一1的调整作用,说明了该药能改善ITP时由收缩因子引起的循环障碍。3.4.含紫疲颖粒家兔血清对经慢性工TP患者血清损伤的人脐静脉内皮细胞ET一lmRNA和eNOSmRNA表达的调控 结果显示:与正常组比较,模型组ET一lmRNA表达增强和eNOSmRNA表达减弱说明慢性ITP患者血清中含有某种成分,对人脐静脉内皮细胞ET一lmRNA和eNOSmRNA的表达造成相应的影响,在分子水平阐明慢性ITP气滞血癖的物质基础;含药血清的调整作用是紫疲颗粒益气活血、祛癖止血作用在分子水平的体现。4.结论 ①血小板计数等ITP药效学指标及小鼠游泳时间等气虚血疲的药效学指标说明气虚血癖型ITP动物模型制作成功;紫疲颗粒的药效结果也反证了这一点。 ②通过ITP动物模型血管内皮细胞结构及内皮活性因子的客观变化阐明了其气虚血癖证这一证候特点及紫疲颗粒的方证相关性。 ③紫疲颗粒血清药对经慢性工TP患者血清损伤的人脐静脉内皮细胞ET一lmRNA和eNOSmRNA的表达有明显的调控作用,从分子水平进一步验证了慢性工TP气虚血癖证这一病机以及紫疲颗粒的方证相关性。